Eine neuartige Raman-spektroskopische Methode zum Nachweis von Blutspuren auf einem störenden Substrat

Aug 20, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5384 (2023) Diesen Artikel zitieren

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An einem Tatort entdeckte Spuren von Körperflüssigkeiten sind eine Hauptquelle für DNA-Beweise. Die Raman-Spektroskopie ist eine vielversprechende universelle Technik zur Identifizierung biologischer Flecken für forensische Zwecke. Zu den Vorteilen dieser Methode gehören die Möglichkeit, mit Spurenmengen zu arbeiten, eine hohe chemische Spezifität, keine Probenvorbereitung erforderlich und die zerstörungsfreie Natur. Allerdings schränken häufige Substratinterferenzen die praktische Anwendung dieser neuartigen Technologie ein. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden zwei Ansätze namens „Reducing a Spectrum Complexity“ (RSC) und „Multivariate Curve Resolution Combined with the Additions Method“ (MCRAD) zur Erkennung von Blutflecken auf mehreren gängigen Substraten untersucht. Bei letzterem Ansatz wurden die experimentellen Spektren numerisch mit einem bekannten Spektrum einer Zielkomponente „titriert“. Es wurden die Vor- und Nachteile beider Methoden für die praktische Forensik bewertet. Darüber hinaus wurde ein hierarchischer Ansatz vorgeschlagen, um die Möglichkeit falsch positiver Ergebnisse zu verringern.

An einem Tatort entdeckte Körperflüssigkeitsspuren spielen eine wichtige Rolle bei der Rekonstruktion des Ereignisses und sind die Hauptquelle für DNA, RNA usw. Die meisten aktuellen Methoden zur Erkennung und Identifizierung von Körperflüssigkeiten basieren auf biochemischen Reaktionen1. Es wurden mehrere mutmaßliche und bestätigende Tests für Blutflecken entwickelt, die häufig an den Schauplätzen von Gewaltverbrechen gefunden werden. Vermutliche Blutuntersuchungen, die vor Ort durchgeführt werden können, basieren hauptsächlich auf der Peroxidase-Katalyse von Hämoglobin (Hb) aus roten Blutkörperchen. Diese Tests können möglicherweise zu falsch positiven Ergebnissen führen, die durch Oxidationsmittel in der Umwelt verursacht werden2,3. Bestätigungstests für Blut, einschließlich Teichmann- und Takayama-Hämoglobinkristalltests, und immunologische Tests wie ELISA- und LDH-Assays sind arbeitsintensiv und kostspielig und erfordern eine Laborumgebung4. Für die Identifizierung von Körperflüssigkeiten, einschließlich Blut, wurden kürzlich mehrere neue Technologien entwickelt. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie und Kapillarelektrophorese können eine bestätigende Identifizierung aller Hauptkörperflüssigkeiten ermöglichen. Diese Tests sind jedoch zeitaufwändig und erfordern eine umfangreiche Probenvorbereitung und eine Laborumgebung5,6. Die Analyse der mRNA-Expression wurde aufgrund ihrer Spezifität und Empfindlichkeit auch in der Forensik als Instrument zur Identifizierung von Körperflüssigkeiten und -geweben eingeführt, indem sie auf die RNA-Sequenzierung hochregulierter Biomarker abzielt. Diese RNA-Tests wurden erfolgreich auf die Untersuchung von Multiplex-Körperflüssigkeitsproben ausgeweitet, die möglicherweise in Fällen sexueller Übergriffe gefunden wurden7,8.

Spektroskopische Methoden wie IR, UV/Vis-Absorption und Fluoreszenz haben nachweislich ein großes Potenzial für die Erkennung und Identifizierung von Körperflüssigkeitsspuren9,10,11,12,13. Diese Techniken sind zerstörungsfrei und könnten am Tatort eingesetzt werden, da tragbare kommerzielle Instrumente verfügbar sind. Unter diesen neuen Methoden erscheint die Raman-Spektroskopie als universelle, bestätigende Methode zur Identifizierung aller forensisch relevanten Körperflüssigkeiten aufgrund ihrer Spezifität, Benutzerfreundlichkeit, der erforderlichen minimalen Probenvorbereitung und der Möglichkeit, am Tatort durchgeführt zu werden, sehr attraktiv4 ,14,15,16. Zu den Vorteilen der Raman-Spektroskopie in der Forensik gehören die Möglichkeit, mit einer kleinen Materialmenge von nur einigen Pikogramm oder Femtolitern zu arbeiten, eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der chemischen Zusammensetzung und Struktur einer Probe sowie eine berührungslose und zerstörungsfreie Analysemethode. Raman-Spektroskopie wird bereits von Strafverfolgungsbehörden zur bestätigenden Identifizierung von Arzneimitteln, Spurennachweisen, Farb- und Faseranalysen usw. eingesetzt.17,18. Die chemometrische Analyse in Kombination mit Raman-Spektroskopie ermöglicht die bestätigende Identifizierung von Blutflecken19,20, die Bestimmung der Zeit seit der Ablagerung21, die Unterscheidung von menschlichem und tierischem Blut22 und die Bereitstellung phänotypischer Informationen über den Spender23,24.

Die Spezifität der Erkennung von Körperflüssigkeitsspuren an einem Tatort kann durch eine darunter liegende Oberfläche (Substrat) wie Bodenfliesen, Papiertaschentuch oder Verunreinigungen beeinflusst werden, die zur Raman-Streuung beitragen können25. Die Oberflächenenergie des Substrats, die Wechselwirkung zwischen Körperflüssigkeit und Substrat, bestimmt die Benetzung und beeinflusst die endgültige Morphologie des getrockneten Biofilms26,27. Ein Substrat kann eine um Größenordnungen stärkere Raman-Streuung erzeugen als ein Körperflüssigkeitssignal. Um die Raman-Spektroskopie in der praktischen Forensik umzusetzen, muss das Interferenzsignal von gemeinsamen Substraten überwunden werden28. Ein beliebter experimenteller Ansatz zur Vermeidung von Substratinterferenzen ist die Wiederherstellung des Ausgangszustands einer Körperflüssigkeit durch Auflösen einer Probe in Wasser25. Dies ist jedoch zeitaufwändig und destruktiv, da die Zugabe von Wasser zu getrockneter Körperflüssigkeit, begleitet von chemischen Reaktionen, die Raman-Spektren beeinflussen kann. Daher ist das entscheidende Problem bei der Identifizierung von Körperflüssigkeitsspuren die Störung durch ein Substrat. Dieses Problem kann auf zwei Arten gelöst werden: Betrachten eines Substrats als zusätzliche Komponente in einer Kombination aus „Probe und Substrat“ oder Extrahieren von Raman-Spektren einer Zielkörperflüssigkeitsprobe aus dieser Kombination, ohne Substrateigenschaften zu definieren.

Ersteres kann durch Methoden realisiert werden, die einer multivariaten Kurvenauflösung ähneln, die auf einem bilinearen Modell eines komplexen Mischungsspektrums in Form einer Überlagerung von Beiträgen reiner Komponenten basiert29,30,31. Im Allgemeinen wird das Problem durch einen Gleichungssatz beschrieben:

wobei \({\varvec{S}}\) die Matrix aller Komponentenspektren in einer Zusammensetzung ist, \({\varvec{C}}\) die Matrix der Konzentrationen ist und \({\varvec{W}} \) ist die Matrix experimenteller Spektren32. Hier bedeutet das hochgestellte Zeichen \(t\) eine Matrixtransposition. Eines der Hauptprobleme hierbei besteht darin, Standard-Raman-Spektren einer Körperflüssigkeit und eines Substrats getrennt zu haben. Letzteres lässt sich durch konsequente Messungen leicht lösen. Die einzige Möglichkeit, das Standardspektrum einer Körperflüssigkeit zu erfassen, besteht darin, es mithilfe eines Substrats mit minimaler Wechselwirkung zu messen. Boyd et al.33 verglichen die Raman-Streuung von Blutproben, die auf verschiedenen Substraten aufgebracht waren, darunter Borosilikatglas, einem Siliziumwafer, einem Polyethylenbecher und einem mit handelsüblicher Aluminiumfolie beschichteten Objektträger. Es wurden Raman-Streuungspeaks von allen Substraten außer Aluminiumfolie festgestellt. Daher ist das AI-Substrat am besten für die Aufnahme von Standard-Raman-Spektren von Zielsubstanzen geeignet. Dieser Ansatz wurde angewendet, um Mehrkomponenten-Raman-Spektren zu differenzieren und Interferenzen durch Substratbeiträge auszuschließen34,35,36. Sikirzhytskaya et al.35 verwendeten erfolgreich alternierende Kleinste-Quadrate-Statistiken und multivariate Kurvenauflösung, um Blutsignaturen in den experimentellen Raman-Spektren biologischer Proben in Gegenwart von Kontaminanten zu entschlüsseln. Gautam et al.36 nutzten die partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate, um das Alter von Blutproben bei Vorhandensein von Polymersubstratinterferenzen mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Sie gingen davon aus, dass das Polymer homogen ist und zu allen Spektren den gleichen Beitrag leistet.

Die Identifizierung einer Zielkörperflüssigkeit auf einem störenden Substrat ohne Definition ihrer Eigenschaften (das Wissen über \({\varvec{S}}\) ist nicht vollständig) ist attraktiver. In dieser Situation gilt Gl. (1) kann für den Fall gelöst werden, dass wir experimentelle Spektren für die Zusammensetzungen mit unterschiedlichen Konzentrationen einiger Komponenten in einem Gemisch während seiner Entwicklung haben, beispielsweise im Zusammenhang mit einem chemischen Prozess (Manne-Bedingung in einem Konzentrationsraum, siehe Abb. 137). .) Eine Manne-Bedingung bedeutet, dass Konzentrationen von zwei Komponenten in einer Mischung identifiziert werden können, wenn Intervalle der Evolutionsvariablen, die ihrer Funktion \(f\left(t\right)\) entsprechen, ungleich Null sind (der Funktionsträger ist in Abb . 1) überlappen sich nicht. Tatsächlich bedeutet dieser Zustand, dass die Konzentration einer bestimmten Komponente wiederhergestellt werden kann, wenn während dieser Mischungsentwicklung eine Situation auftritt, in der die Konzentration der verbleibenden Komponenten Null ist. Letzteres wird für das störende Substrat kaum umgesetzt, da es bedeutet, dass wir einen räumlichen Punkt haben sollten, an dem kein Substrateinfluss auftritt. Natürlich kann die entgegengesetzte Aufgabe der Identifizierung der Substrateigenschaften leicht gelöst werden, indem an einem räumlichen Punkt auf der Substratoberfläche gemessen wird, an dem kein Bioflüssigkeitsfleck vorhanden ist. Eine schwächere Version dieser Bedingung kann für eine Zielkomponente erfüllt werden, indem die multivariate Kurvenauflösung mit der Additionsmethode (MCRAD) kombiniert wird38,39. Letzteres kann durch Variation der Konzentration einer Zielkomponente durch chemische Manipulationen oder virtuell (durch Computersimulationen) umgesetzt werden. Der Vorteil des MCRAD besteht darin, dass lediglich die Zielkomponentenkonzentration variiert werden muss. Daher benötigen wir keine Angaben oder besondere Bedingungen zum störenden Untergrund.

Mannezustand in einem Konzentrationsraum. Dabei ist \(f(t)\) die Konzentration einer Komponente (durchgezogene Linie) und einer anderen Komponente (gepunktete Linie). Die Funktionsträger werden als Rechtecke dargestellt. Gemäß der Manne-Bedingung sollten sich die Funktionsträger nicht vollständig überlappen. Dabei entspricht der schwarze Stern dem Bereich der Evolutionsvariablen \(t\), in dem die „schwarze“ Komponente ohne den Einfluss der „blauen“ Komponente analysiert werden kann. Der umgekehrte Fall ist mit einem blauen Stern gekennzeichnet.

Ein weiterer Ansatz zur Extraktion einer bestimmten Komponentenkonzentration aus einem IR-Absorptionsspektrum eines komplexen Gasgemisches wurde von uns entwickelt40,41. Der Ansatz beginnt mit der Entartung von Gl. (1) in folgender Form:

wobei \({S}_{org}\) ein experimentelles Spektrum ist, \({S}_{ref}\left(k\right)\) ein Spektrum einer Zielkomponente ist, \(C\) ihr Spektrum ist Konzentration (oder ein anderes quantitatives Merkmal dieses Komponentenvolumenanteils), die a priori unbekannt ist, und \({S}_{blank}\) ist ein unbekanntes Spektrum anderer Komponenten in einer Mischung. \(k\) ist eine Wellenzahl (Raman-Verschiebung). Dieser Ansatz nutzt das Konzentrationswiederherstellungskriterium für eine bestimmte Komponente basierend auf der Reduzierung der Spektrumkomplexität (RSC), wenn die Spektralkomponente aus dem experimentellen Spektrum entfernt wird (siehe Abb. 2)42. Mit diesem Kriterium ist die Minimierung der folgenden Funktion verbunden:

Die funktionale (3) Abhängigkeit vom variablen Parameter \(\widetilde{C}\). Hier ist der wahre Konzentrationswert \(C\) gleich 1.

Dabei ist es erforderlich, das Spektrum der Zielkomponente zu kennen und diese muss spektrale Besonderheiten gegenüber anderen Komponenten aufweisen. Letzteres ist die gleiche Manne-Bedingung, jedoch in einem Spektralraum, der der Bedingung der Anwendbarkeit von DIAL- (Differential Absorption LIDAR)43 oder DOAS- (Differential Optical Absorption Spectroscopy)44 Ansätzen zur Untersuchung der molekularen Zusammensetzung der Atmosphäre mithilfe von Multifrequenz-Absorptionsdaten ähnelt. MCRAD und RSC implementieren einen Zerlegungsansatz „eins pro Schritt“, der für den praktischen Einsatz besser geeignet ist. Es ist zu beachten, dass einige Variationen von MCRAD bereits zur Wiederherstellung einer bekannten Raman-Spektralkomponente aus einer komplexen Matrix38,39 verwendet wurden, während RSC noch nicht für diesen Zweck verwendet wurde.

Diese Arbeit untersuchte die Leistungsfähigkeit, Einschränkungen und Vorteile des „One-per-Step“-Zersetzungsmodells für die Erkennung und korrekte Identifizierung von Blutspuren auf störenden Substraten mithilfe der Raman-Spektroskopie. Wir haben MCRAD und RSC auf Raman-Spektraldaten angewendet, die für Blutflecken auf verschiedenen gängigen Substraten, reine Blutflecken und reine Substrate erhalten wurden. Die RSC-Methode erkannte Blut mit einer Konfidenzwahrscheinlichkeit von nahezu 100 %. Die MCRAD-Methode zeigte nachweislich eine schlechte Fähigkeit zur Erkennung von Blutflecken auf blauem Polyester, Denim, weißem Polyester und Baumwollstoffen. Die Kontrollstudien zielten auf den scheinbaren Blutnachweis auf reinen Substraten ab. Beide Methoden zeigten eine gute, aber nicht perfekte Fähigkeit, nachzuweisen, dass auf reinen Substraten keine Blutflecken vorhanden sind. Unserer Meinung nach sind falsch positive Fehler mit einer Ähnlichkeit zwischen Blut- und Substrat-Raman-Spektren verbunden. Wir haben diese Schlussfolgerung anhand des Soergel-Abstands zwischen Raman-Spektren von Blut und einem Substrat veranschaulicht.

Um realistische Blutfleckenbeweise zu simulieren, die typischerweise am Tatort gefunden werden, wurden mit einer Mikropipette Vollbluttröpfchen mit einem Volumen von 10 μl auf die Oberfläche von weißem Baumwollstoff, weißem Polyesterstoff, blauem Polyesterstoff und Jeansstoff aufgetragen . Die Blutflecken wurden über Nacht unter Umgebungsbedingungen trocknen gelassen. Als Standardprobe wurde ein Blutfleck auf Aluminiumfolie auf einem nicht störenden Substrat45 verwendet. Mithilfe der automatischen Kartierung wurden mehrere Raman-Spektren von verschiedenen Stellen der Probe erfasst, um mögliche Heterogenität der Probe zu untersuchen19. Ausgewählte Raman-Spektren von Blutflecken auf verschiedenen Substraten sowie Raman-Spektren der Substrate sind in Abb. 3 dargestellt. Das Raman-Spektrum von Blut auf Al-Folie stimmt mit den zuvor berichteten reinen Blutspektren überein19. Spektren von Blutflecken auf verschiedenen Substraten zeigen einen signifikanten Beitrag von Substraten. Das Raman-Spektrum eines Blutflecks auf Denim wird von Denim dominiert, was die Notwendigkeit einer speziellen Datenanalyse zur Erkennung von Blutspuren auf solchen störenden Substraten weiter verdeutlicht.

Ausgewählte Raman-Spektren von Substraten aus reinem blauem Polyester, Denim, Baumwollstoff und weißem Polyester (a) sowie den Blutflecken auf Al-Folie auf denselben reinen Substraten (b).

Der Ursprung spezifischer Blut-Raman-Peaks ist wie folgt. Der ausgeprägte Peak bei 1658 cm−1 entspricht den Amid-I-Schwingungen in einer Peptidkette. Der Peak bei 1003 cm−1 und ein Dublett bei 826 und 856 cm−1 entsprechen Phenylalanin und Tyrosin. Die Bande bei 754 cm−1 ist mit dem Pyrrolring verbunden. Die Kohlenhydrate liefern Raman-Peaks bei 960, 1032, 1127 und 1208 cm−1, die mit der Streckung der C-O-, C-C-, C-O-H- und C-O-C-Bindungen zusammenhängen. Peaks bei 1449 und nahe 1340 cm−1 können mit Lipoproteinen in Verbindung gebracht werden, ihr Gehalt variiert jedoch individuell. Die Raman-Banden bei 623 und 644 cm−1 beziehen sich auf Phenylalanin bzw. Tyrosin19,46,47.

Der intensivste Raman-Peak des Denim-Stoffs mit 1573 cm−1 wird dem Indigo zugeschrieben. Raman-Banden von 1030 bis 1150 cm−1 und bei 1380, 1340, 1090 und 460 cm−1 entsprechen Baumwollfasern28,48. Diese Bänder werden in weißem Baumwoll-Raman-Spektrum präsentiert.

Für blauen Polyester entspricht die Raman-Bande bei 1725 cm−1 der Streckung der Carbonylgruppe C=O, die Bande bei 1612 cm−1 entspricht C–C-Schwingungen im aromatischen Ring. Die 702 cm−1-Bande entspricht auch der Streckung der CC-Bindungen im Ring. Die Raman-Banden bei 859 cm-1, 998 cm-1, 1096 cm-1, 1179 cm-1, 1291 cm-1, 1416 cm-1, 1463 cm-1 gehören zu einem Polyethylenterephthalat49. Bei weißem Polyester sind die Raman-Bänder bei 1637 cm-1, 1440 cm-1, 1080 cm-1, 1280 cm-1, 1300 cm-1, 1128–1060 cm-1 und 1235 cm-1 mit Nylonstreifen verbunden50.

Ein Raman-Spektrum eines Blutflecks auf einem störenden Substrat wird durch die Gleichungen beschrieben. (1) oder (2), wobei \(C\) der Volumenanteil (VF) des Blutes ist. Die Ergebnisse der Anwendung von MCRAD und RSC für den Satz experimenteller Raman-Spektren von Blutflecken auf getesteten Substraten sind in Abb. 3 dargestellt. Es wurden Berechnungen für einen vollständigen Raman-Spektraldatensatz für einen Blutfleck auf jedem gemeinsamen Substrat und jeder nicht störenden Al-Folie durchgeführt. Letzteres galt als Blutspektralstandard. Die Ergebnisse der Wiederherstellung des Blutvolumenanteils werden in Form der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion \(f\left(C\right):\) dargestellt.

welches die Verteilung der wiederhergestellten Blutvolumenfraktionswerte charakterisiert. Die wiederhergestellten Volumenanteile werden durch alle Kombinationen experimenteller Raman-Spektren eines Blutflecks auf einem bestimmten Substrat und experimenteller Raman-Spektren eines Blutflecks auf einer Al-Folie definiert. Die weitere Datenvorverarbeitung umfasste die Berechnung eines Mittelwerts und einer Standardabweichung für jeden Wert des wiederhergestellten Volumenanteils \(C.\). Es wurde festgestellt, dass der MCRAD Mittelwerte von \(C\) nahe Null vorhersagte, während der RSC a vorhersagte Der Mittelwert liegt bei etwa 0,1 für den Blutfleck auf dem blauen Polyester, 0,4 für Denim und weißen Polyester und 0,6 für Baumwollstoff. Diese Ergebnisse wurden insbesondere für Proben erhalten, die Blutflecken auf den Substraten enthielten. Daher ergab MCRAD ein quantitativ falsches Ergebnis (falsch negativ). Um diese Schlussfolgerung mithilfe eines statistischen Ansatzes weiter zu validieren, haben wir die Hypothese der Abwesenheit von Blut auf einem Substrat anhand des Standardbewertungskriteriums6,7 bewertet: Z = (0 − μ)/σ, wobei μ der Mittelwert in einem Datensatz ist und σ ist die Standardabweichung. Dabei zeigt der Z-Score an, wie weit der Mittelwert eines experimentellen Zufallsparameters auf einer Skala der Standardabweichung von Null entfernt ist. Mit anderen Worten: Je größer |(0 − μ)|/σ ist, desto sicherer können wir sagen, dass der geschätzte Parameter von Null verschieden ist. Die Ergebnisse der Z-Score-Berechnungen und die Konfidenzwahrscheinlichkeit P des Fehlens von Blut in der Probe sind in Tabelle 1 für jede der in Abb. 4 dargestellten Verteilungen \(f\left(C\right),\) dargestellt. Diese Verteilungen wurden unter Verwendung der MCRAD- und RSC-Methoden für alle Kombinationen jedes Raman-Spektrums eines Blutflecks auf einer Al-Folie mit jedem Raman-Spektrum eines Blutflecks auf einem entsprechenden Substrat berechnet. Anschließend wurden der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet.

Der durch MCRAD und RSC wiederhergestellte Blutvolumenanteil in experimentellen Raman-Spektren von Blutflecken auf Substraten aus blauem Polyester (a), Denim (b), Baumwollstoff (c) und weißem Polyester (d).

Wenn wir das Konfidenzniveau von 95 % wählen, entspricht es dem Intervall von −1,96 bis 1,96 in Tabelle 1. Die anhand von Z-Scores berechneten Konfidenzwahrscheinlichkeiten für das Fehlen von Blut in einer Stichprobe sind in Tabelle 1 dargestellt.

Daher zeigt die MCRAD-Methode mit einer Konfidenzwahrscheinlichkeit von nicht weniger als 95 %, dass bei den Blutflecken auf blauem Polyester und Denim kein Blut vorhanden ist. Die gleichen Vorhersagen werden für weißes Polyester mit einer Konfidenzwahrscheinlichkeit von 59 % erfüllt. Das MCRAD sagt das Vorhandensein von Blut auf einem Baumwollstoff mit einer Konfidenzwahrscheinlichkeit von 91 % voraus. Die RSC-Methode weist das Vorhandensein von Blut für dieselben Proben mit einer Konfidenzwahrscheinlichkeit von nahezu 100 % nach.

Für eine neue forensische Methode ist es von großer Bedeutung, das Potenzial für falsch positive Ergebnisse zu ermitteln. Die Ergebnisse eines Versuchs, Blut auf reinen Substraten mithilfe von MCRAD und RSC nachzuweisen, sind in Abb. 5 dargestellt. Die Blutvolumenanteile wurden wie folgt geschätzt. Wir verwendeten die MCRAD- und RSC-Methoden für alle Kombinationen jedes Raman-Spektrums einer Blutprobe auf einer Al-Folie mit dem Raman-Spektrum einer Probe des entsprechenden reinen Substrats. Insgesamt zeigt RSC im Vergleich zu MCRAD ein angemessenes Maß an Fehlern für mehr Substrate. Das Problem ist ein Denim-Substrat. Unter Berücksichtigung der in den Abbildungen dargestellten Ergebnisse. 4 und 5, RSC scheint eine universellere Methode zu sein, wenn wir keine a priori Informationen darüber haben, ob und um welche biologische Probe es sich auf einem Substrat handelt.

Der durch MCRAD und RSC wiederhergestellte Blutvolumenanteil in experimentellen Raman-Spektren von Substraten aus reinem blauem Polyester (a), Denim (b), Baumwollstoff (c) und weißem Polyester (d).

Unserer Meinung nach ist die Tendenz bei der Extraktion einer Blutvolumenfraktion aus einem reinen Substrat (siehe z. B. Abb. 4b) mit einer Ähnlichkeit zwischen Blut und den Raman-Spektren des Substrats verbunden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir den Soergel-Abstand verwendet, um die Ähnlichkeit zweier Spektralkurven quantitativ abzuschätzen:

wobei \({x}_{i}\) und \({z}_{i}\) diese Kurvenabszissenwerte (Raman-Signal) für dieselbe Ordinate (Raman-Frequenzverschiebung) sind. \(N\) ist die Anzahl der Datenpunkte in den Kurven. Bezeichnen wir als \({S}_{l}\) den gemäß (4) berechneten Wert von \(S\), jedoch für zwei Spektren, die vorläufig über ein gleitendes Spektralfenster einschließlich \(l\) Punkten gemittelt werden (l<\(N).\) Mit anderen Worten bedeutet dies, dass Raman-Spektren in den aufeinanderfolgenden Intervallen einschließlich \(l\) Spektralpunkten gemittelt werden. Hier verwendeten wir eine spektrale vorläufige Normalisierung basierend auf der Fläche unter einer Spektrumskurve. In diesem Fall ist \(\underset{l\to N}{\mathrm{lim}}{S}_{l}=0\). Beachten Sie, dass \({S}_{l}=0\) für identische Kurven für jedes \(l\). Daher kann \({S}_{l}(l)\) Aufschluss über die Ähnlichkeit der beiden Spektren geben. Die Ergebnisse der \({S}_{l}\)-Berechnung für ein Blutspektrum auf einer Al-Folie und einem gemeinsamen Substrat sind in Abb. 6 dargestellt. Berechnungen wurden für mittlere Raman-Spektren von Blut auf einer Al-Folie und räumlich durchgeführt gemittelte Raman-Spektren eines bestimmten Substrats. Um \({S}_{l}\left(l\right),\) zu berechnen, haben wir zunächst Raman-Spektren für spektrale Teilintervalle mit der Länge \(l\) gemittelt. Dann haben wir \({S}_{l}\left(l\right)\) für alle Kombinationen jedes Raman-Spektrums einer Blutprobe auf einer Al-Folie mit jedem Raman-Spektrum einer Blutprobe auf einem entsprechenden Substrat berechnet. Anschließend wurden der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet. Dieser Vorgang wurde für \(l\) wiederholt, das im Intervall [1, \(N\)] variiert wurde.

Berechnete Abhängigkeit des Soergel-Abstands \({S}_{l}\) von der Anzahl der Punkte \(l\) im gleitenden Spektralfenster für Blutfleckenspektren auf Al-Folie und üblichen Substraten.

Wir sehen, dass die Abhängigkeit \({S}_{l}\) von \(l\) für Denim-Substrate im Vergleich zu anderen Substraten kleinere Werte aufweist, insbesondere für \(l>400\). Dieses Substrat führt zu den größten Fehlern bei der Schätzung eines Blutvolumenanteils auf den reinen Substraten unter Verwendung des RSC (siehe Abb. 5b). Ausführlicher sind die für einzelne gleitende Spektralfenster für verschiedene Raman-Frequenzverschiebungen berechneten Soergel-Abstände in Abb. 7 dargestellt. Diese Berechnungen wurden auf die gleiche Weise wie die in Abb. 6 dargestellten Ergebnisse durchgeführt. Wir sehen, dass der Unterschied zwischen Blut und Die Raman-Spektren von Denim sind im Vergleich zu anderen Substraten minimal. Dies kann ein Grund für den größten Fehler in den in Abb. 5 dargestellten Ergebnissen sein.

Ergebnisse der Soergel-Abstandsberechnungen in einem einzelnen gleitenden Spektralfenster für verschiedene Raman-Banden. Der Abstand wird als Mittelwerte zwischen den Raman-Spektren von Blut auf Al-Folie und Substraten aus reinem blauem Polyester (a), Denim (b), Baumwollstoff (c) und weißem Polyester (d) dargestellt. Dabei ist \(i\) die Anzahl der gleitenden Spektralfenster.

Daher können Metriken wie der Soergel-Abstand die spektralen Besonderheiten beim Vergleich von Spektren abschätzen. Dennoch muss noch mehr Arbeit geleistet werden, um diese interessante Beobachtung zu verstehen, obwohl dies den Rahmen dieser Studie sprengen würde.

Im Allgemeinen wird die Genauigkeit jeder Analysemethode einer Gemischzerlegung unter Verwendung von Raman-Spektroskopiedaten definiert durch: (i) eine Ähnlichkeit der Raman-Spektren reiner Komponenten, die in einer untersuchten Zusammensetzung vorhanden sind; (ii) das Verhältnis der Volumenanteile der reinen Komponenten. Der Nachweis einer Zielkomponente wird vor allem dann erschwert, wenn ihre große Ähnlichkeit und ihr geringer Volumenanteil relativ zu anderen Komponenten in der untersuchten Zusammensetzung vorliegen.

Die RSC-Methode basiert auf der Subtraktion eines Ziel-Raman-Spektrums mit einem unbekannten Gewichtungskoeffizienten C von einem experimentellen Spektrum einer komplexen Probe, wodurch ein Minimum der Zielfunktion erreicht wird (3). Der mögliche Grund für die größere Stabilität und Robustheit des RSC ist folgender. RSC basiert auf der Anwendung der L1-Norm auf eine Funktion \(\left|\frac{{d(S}_{org}-C \cdot {S}_{ref})}{dk}\right|\ ) durch eine Schätzung eines Integrals in Gl. (3). Die L1-Norm ist mit der Funktionsintegration über ein unabhängiges Variablenvariationsintervall verbunden. Lassen Sie uns zufälliges Rauschen explizit in die Beschreibung einbeziehen. Sowohl \({S}_{org}\) als auch \({S}_{ref}\) können eine additive Zufallsnase (\({R}_{1}\left(k\right), {R }_{2}(k))\):

wobei \({S}_{org}^{0}, {S}_{ref}^{0}\) die entsprechenden Merkmale ohne Rauschen sind. Dann gilt Gl. (3) nimmt die Form an

Seien \({R}_{1}\left(k\right), {R}_{2}(k)\) stationäre Zufallsfunktionen mit Null-Mittelwerten:

wobei \(\nu\) die Amplitude der Rauschkomponente ist, die in einem relativen Bruchteil eines Mittelwerts des Satzes von Raman-Spektren von Blut auf einer AI-Folie dargestellt wird, und \(\mathrm{Rand}(\mathrm{k} )\) ist eine Menge von Zufallswerten, die im Intervall [-0,5, 0,5] variiert werden.

Wenn die Funktion

ein ergodischer Zufallsprozess ist, dann ist die Integration dieser Funktion über die Evolutionsvariable \(k\) gleichbedeutend mit der Mittelung über ein Ensemble von Erkenntnissen. Letzteres bewirkt eine Rauschunterdrückung und beeinflusst die Wiederherstellungsergebnisse der Zielkomponentenkonzentration (Volumenanteil). Um hierzu Argumente zu erhalten, haben wir numerische Experimente mit den Gleichungen durchgeführt. (7) und (8), begrenzt durch einen Rauschpegel von bis zu 5 % des Mittelwerts des verwendeten Raman-Spektrensatzes, der die typischen Werte der Rauschkomponente deutlich übersteigt. Wir haben einen Satz von 100 Realisierungen von Zufallsfunktionen \({R}_{1}\left(k\right),\) \({R}_{2}(k)\) gemäß Gl. synthetisiert. (8) mit \(\nu\) im Intervall [0,0, 0,05] variiert und mit Kriterium (6) den Volumenanteil \(\widehat{C}\) wiederhergestellt. Die Berechnung des Letzteren wurde wie folgt durchgeführt. Wir haben jedes Raman-Spektrum einer Blutprobe auf einer Al-Folie als Referenz genommen und es verwendet, um den Volumenanteil in den verbleibenden Raman-Spektren einer Blutprobe auf einer Al-Folie wiederherzustellen. Dieses Verfahren wurde für alle anderen Raman-Spektren einer Blutprobe auf einer Al-Folie wiederholt. Anschließend wurden der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet. Die Ergebnisse sind in Abb. 8 dargestellt. Man kann sehen, dass das Vorhandensein solcher Rauschpegel einen relativen Fehler \(\delta C\) bei der Wiederherstellung des Volumenanteils der Zielkomponente (Blut) von bis zu 1 % verursacht. Hier ist \(\delta C=\left|C-\widetilde{C}\right|/C.\) Daher ist RSC ziemlich robust gegenüber zufälligen Schwankungen der Spektraldaten aufgrund zufälliger experimenteller Fehler und Variabilität zwischen Gruppen.

Abhängigkeit des Wiederherstellungsfehlers des Volumenanteils der Zielkomponente (Blut) von der Amplitude des additiven Rauschens \(\nu\). Hier beträgt der wahre Volumenanteilswert 1,0.

Ein möglicher Grund für die schwache Stabilität und Robustheit von MCRAD ist folgender. MCRAD basiert auf Gl. (1) Lösung, wobei die Konzentrationsmatrix \({\varvec{C}}\) einen Satz von \({\widehat{C}}_{j}+\widetilde{C}\)-Werten enthält, wobei \ (\widetilde{C}\) ist die unbekannte Konzentration (Volumenanteil) einer Blutprobe und \({\widehat{C}}_{j}\) sind bekannte zusätzliche Volumenanteile (VFs) nach dem Standardprinzip Zusatz. Die Auswertung von \(\widetilde{C}\) erfolgt durch eine iterative Lösung des Gleichungssatzes38,39:

Das iterative Verfahren basiert auf der Anwendung der L2-Norm (der euklidischen Norm) auf eine Funktion ähnlich \(({\varvec{W}}-{\varvec{C}}{{\varvec{S}}}^ {t})\), wobei \({\varvec{S}}\) die Matrix aller Komponentenspektren in einer Zusammensetzung ist, \({\varvec{C}}\) die Matrix der Konzentrationen ist und \( {\varvec{W}}\) ist die Matrix experimenteller Spektren. Selbst wenn es sich bei einem Spektrum mit zusätzlichem Zufallsrauschen um einen ergodischen Zufallsprozess handelt, kann die L2-Norm nicht über ein Ensemble gemittelt werden.

Wir haben die Simulation mit MCRAD mit demselben Rauschmodell (5), (7) und demselben Rauschpegel wie für den RSC durchgeführt. Ein Raman-Spektrum eines Blutflecks auf Al-Folie wurde als Referenz verwendet, um den Volumenanteil im restlichen Raman-Spektrum einer Blutprobe auf Al-Folie wiederherzustellen. Dieses Verfahren wurde für alle anderen Raman-Spektren von Blut auf Al-Folie wiederholt. Anschließend wurden der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet. Die Ergebnisse der Wiederherstellung der Konzentration (Volumenanteil) \(C\) in 100 Simulationen sind in Abb. 9 dargestellt. Wir sehen, dass der Einfluss von Rauschen auf die Genauigkeit der Konzentrationswiederherstellung viel stärker ist als der des RSC. Ein möglicher Grund ist, dass die euklidische Norm die Nutzung der Vorteile ergodischer Zufallsprozesse im Hinblick auf die Rauschreduzierung nicht zulässt. Dies kann ein Grund für die Reaktionsfähigkeit des MCRAD-Algorithmus auf zufälliges Rauschen sein.

Abhängigkeit des Wiederherstellungsfehlers des Volumenanteils der Zielkomponente (Blut) von der Amplitude des additiven Rauschens \(\nu\). Hier beträgt der wahre Volumenanteilswert 1,0.

Potenzielle Fehler (falsch positive und falsch negative Ergebnisse) einer neuen Methode könnten das Interesse forensischer Praktiker erheblich verringern. Falsch negative Ergebnisse aufgrund der niedrigen Nachweisgrenze könnten dazu führen, dass wertvolle Beweise fehlen. Falsch positive Ergebnisse können zu einer erheblichen Zeit- und Ressourcenverschwendung führen. Um potenzielle Fehlalarme für die hier entwickelte Methode weiter zu reduzieren, könnte eine zweite Stufe der Datenanalyse als Teil eines hierarchischen Ansatzes durchgeführt werden. Bemerkenswert ist hier, dass die Durchführung einer zusätzlichen Analyse aufgrund der schnellen Spektralmessungen und der hohen Geschwindigkeit/Effizienz moderner Computer die Gesamttestzeit nicht merklich verlängert. Die zweite Datenanalyse, die wir vorschlagen, ist der Vergleich der erhaltenen Raman-Spektren mit den Spektren des entsprechenden reinen Substrats. Letzteres könnte sich bereits in der Spektralbibliothek der Software befinden. Wenn nicht, könnte die Kartierung des reinen Substrats schnell am Tatort oder im Labor durchgeführt werden, wenn die Beweisprobe auf einem Materialstück bereits gesammelt und an das Labor geliefert wurde.

Natürlich ist das Raman-Spektrum einer analysierten echten Bioflüssigkeitsprobe nicht genau das gleiche wie das Raman-Spektrum eines Etalons und stellt eine Quelle von Verzerrungen dar. Die Variationen in den Raman-Spektren aller Hauptkörperflüssigkeiten hinderten uns jedoch nicht daran, eine 100-prozentige Genauigkeit bei der Identifizierung zu erreichen, als ein hochwertiges Raman-Spektrum für eine „neue“ Probe gemessen wurde, die nicht für den Trainingsdatensatz verwendet wurde14,15. Darüber hinaus ist Blut im Hinblick auf die biochemische Zusammensetzung bei weitem die beständigste Körperflüssigkeit (im Vergleich zu anderen Hauptkörperflüssigkeiten, einschließlich Samenflüssigkeit). Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass wir in dieser Studie ein einziges Referenz-Raman-Spektrum von trockenem Blut verwenden können, im Gegensatz zu einer Reihe einzelner Spektralkomponenten, wie wir es in unserer früheren Arbeit für Samenspuren getan haben38. In dieser Studie haben wir anhand mehrerer Blutflecken auf einem Aluminiumsubstrat ein Referenz-Raman-Spektrum erstellt und dieses Referenzspektrum dann zur Erkennung und Identifizierung von Blutspuren auf störenden Substraten verwendet. Es ist hier sehr wichtig zu betonen, dass die integrierten Blutflecken auf interferierenden Substraten aus Blutproben hergestellt wurden, die nicht für die Entwicklung des Referenz-Raman-Spektrums von Trockenblut (verschiedene Spender) verwendet wurden.

Wenn jedoch Zweifel an der Eignung des verfügbaren Referenzspektrums der biologischen Flüssigkeit für die untersuchte Probe bestehen, kann der RSC in umgekehrter Weise verwendet werden. Wir können das Raman-Spektrum des Substrats an einem räumlichen Punkt ohne Flecken messen. Danach können wir diese Komponente aus dem Raman-Spektrum extrahieren, das an einem räumlichen Punkt bei Vorhandensein einer Kombination aus „Bioflüssigkeitsfleck und Substrat“ gemessen wurde. Der Rückstand ist ein Raman-Spektrum einer spezifischen Bioflüssigkeitsfleckenprobe. Letzteres kann auf jede geeignete Weise identifiziert werden, beispielsweise durch Vergleich mit einer Bibliothek von Raman-Spektren von Bioflüssigkeiten. Die Entscheidung darüber, welches Biofluid präsentiert wird, kann beispielsweise auf einem Fuzzy-Logic-Ansatz basieren, indem „Abstände“ des Rückstands mit „Standard“-Raman-Spektren verschiedener Biofluide aus der Bibliothek verglichen werden. Die Umsetzung dieses Ansatzes ist in Abb. 10 dargestellt. Hier werden die Residuen \({S}_{R}\) zwischen den experimentellen Raman-Spektren von Blutflecken auf einem bestimmten Substrat und den Raman-Spektren desselben reinen Substrats verglichen der Satz \({S}_{0}\) von 100 Raman-Spektren von Blut auf Al-Folie und 100 Raman-Spektren von Samenflüssigkeit auf einer Al-Folie, die wir zuvor gemessen haben19. Der Näherungsfaktor wurde anhand einer Formel berechnet

wobei die Summation über alle Spektralpunkte in den verglichenen Raman-Spektren durchgeführt wird. In allen Fällen können wir daraus schließen, dass das verbleibende Raman-Spektrum dem von Blut entspricht. Daher können wir den Schluss ziehen, dass es grundsätzliche Lösungen für das Problem gibt, dass streng genommen das Fehlen eines absoluten Etalon-Raman-Spektrums eines Biofluids fehlt, das perfekt einer konkreten experimentellen Probe eines Biofluids entspricht, das „hier und jetzt“ analysiert wird. Der grundlegende Hintergrund dieser positiven Schlussfolgerung hinsichtlich der praktischen Nützlichkeit ist wie folgt. Die schwarze Linie in Abb. 1 entspricht den räumlichen Positionen des Vorhandenseins von Bioflüssigkeitsflecken. Dann können wir in einem durch einen blauen Stern markierten räumlichen Bereich das Raman-Spektrum des reinen Substrats messen, da keine Bioflüssigkeitsfärbung vorhanden ist. Daher entspricht diese Situation vollständig der Manne-Bedingung (siehe Abb. 1), wenn die Evolutionsvariable \(t\) eine räumliche Position auf einer Substratoberfläche beschreibt. Eine tiefergehende Analyse ist nicht Gegenstand der aktuellen Studie und wird in künftigen Arbeiten vorgestellt.

Die Wahrscheinlichkeitsdichteverteilung des Näherungsfaktors (9) für die Residuen \({S}_{R}\) zwischen den experimentellen Raman-Spektren von Blutflecken auf einem bestimmten Substrat und den Raman-Spektren desselben reinen Substrats im Verhältnis dazu Satz \({S}_{0}\) der Raman-Spektren von Blut und der Satz der Samenflüssigkeits-Raman-Spektren auf einer Al-Folie: blauer Polyester (a), Denim (b), Baumwollstoff (c) und weiß Polyester (d)-Substrate.

Ein weiteres wichtiges Thema bezüglich der RSC-Robustheit gegenüber falsch-positiven Ergebnissen. Um dies zu bestätigen, können wir erneut das Raman-Spektrum des Substrats an einem räumlichen Punkt ohne Flecken verwenden. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die Implementierung dieses Ansatzes zur Erkennung von Blutflecken auf verschiedenen Substraten. Das Ziel besteht darin, zu bestätigen, dass der erkannte Blutfleck kein falsch positives Ergebnis ist. Wir empfehlen, zusätzliche experimentelle Daten von benachbarten Punkten auf einer Substratoberfläche zu verwenden, die keine Blutspuren enthalten (reines Substrat). Wir verwendeten die einfachste unbeaufsichtigte Klassifizierungsmethode, die Hauptkomponentenanalyse (PCA), um zu testen, ob Raman-Spektren von scheinbaren Blutflecken und einem reinen Substrat unterschieden werden konnten. Abbildung 11 zeigt ein PCA-Score-Diagramm, das für Raman-Spektren erhalten wurde, die von einem Blutfleck auf einem gemeinsamen Substrat und von demselben reinen Substrat gesammelt wurden.

Ein hierarchischer Ansatz zum Testen auf potenzielle Fehlalarme. Die für einen scheinbaren Blutfleck erhaltenen Raman-Spektrendaten werden statistisch mit den für ein reines Substratmaterial erhaltenen Raman-Spektren verglichen. Die mit der ersten und zweiten Hauptkomponente erstellten Ergebnisdiagramme der Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigen eine signifikante Trennung der beiden Klassen von Raman-Spektren für Blutflecken auf allen verwendeten Substraten.

Diese beiden Klassen von Raman-Spektren konnten im Fall von blauem und weißem Polyester und Baumwolle mit hoher Sicherheit unterschieden werden. Es gibt jedoch einige Überschneidungen im Ergebnisdiagramm für Raman-Spektren, die von einem Blutfleck auf Denim-Substrat gesammelt wurden, und denen, die von reinem Denim gesammelt wurden. Wir glauben, dass dies daran liegt, dass Denim ein starkes Raman-Signal hat und das Signal von Blut übertönt. Wie aus Abb. 3 hervorgeht, sind die Raman-Spektren eines Blutflecks auf einem Denim-Substrat den Spektren von reinem Denim sehr ähnlich, ohne merklichen Blutanteil. Dennoch gibt es trotz einiger Überschneidungen eine beträchtliche Anzahl von Punkten im Punktediagramm, die gut getrennt sind. Daher glauben wir, dass der vorgeschlagene Ansatz auch bei Denim Tests auf falsch positive Ergebnisse ermöglichen sollte, wenn Raman-Spektren von mehreren Punkten auf dem Blutfleck gesammelt und mit denen eines reinen Denims verglichen werden. Offensichtlich muss noch mehr Arbeit geleistet werden, um diesen Prozess zu optimieren, einschließlich der Verwendung robusterer statistischer Methoden der überwachten Statistik. Wir planen, in naher Zukunft daran zu arbeiten.

Blutproben wurden von BioIVT, LLC (Westbury, NY) von fünf anonymen Spendern erworben. Die Spender waren negativ für HbsAg, HCV, HIV-1&2, Syphilis und HIV-1-Antigen. Alle Proben wurden auf eines der folgenden Substrate aufgetragen: Aluminiumband, weißer Baumwollstoff, weißer Polyesterstoff, blauer Polyesterstoff und Jeansstoff, wobei 10 μl auf die Oberfläche pipettiert und über Nacht trocknen gelassen wurden.

Zur Erfassung der Raman-Spektren über einen Bereich von 400–1800 cm−1 wurde ein konfokaler Raman-Spektrograph von Renishaw InVia verwendet, der mit einem Leica-Mikroskop für Forschungszwecke, einem 50-fach-Langstreckenobjektiv und einem Renishaw PRIOR-Tisch zur automatischen Kartierung ausgestattet war. Zur Anregung wurde ein 785-nm-Laserlicht verwendet. Die maximale Laserleistung betrug etwa 80 mW. Die Kapazität wurde bei einer Spektrumakkumulierungszeit von 10 s auf zehn Prozent reduziert, um eine Photodegradation zu vermeiden. Die Punktgröße des Anregungsstrahls auf der Probe betrug im Standard-Konfokalmodus und einem 50-µm-Schlitz etwa 2 µm. Mithilfe der automatischen Kartierung wurden mehrere Spektren von verschiedenen Stellen jedes Blutflecks gesammelt, und jedes Spektrum bestand im Durchschnitt aus zehn Ansammlungen. Die höchste Genauigkeit wurde durch die Überprüfung der Gerätekalibrierung vor jeder Analyse mithilfe eines Siliziumstandards sichergestellt. Alle Spektrumsmessungen wurden zunächst mit der Software WiRE 3.4 behandelt, um jegliche Interferenzen durch kosmische Strahlung zu beseitigen. Die Verarbeitung der empfangenen Daten erfolgte mit der MATLAB-Software. Ausreißer wurden mithilfe der Random-Forest-Methode51 entfernt. Die Vorverarbeitung der experimentellen Raman-Spektren erfolgte in drei Schritten: Hintergrundsubtraktion (ein Standardverfahren zur Minimierung des Fluoreszenzbeitrags), zufällige Rauschfilterung und Normalisierung durch die Fläche unter der Kurve. Die Hintergrundsubtraktion wurde durch formerhaltende stückweise kubische Interpolation eines Raman-Spektrums an benachbarten Gitterpunkten in einem gleitenden Spektralfenster mit einer Breite von 200 Spektralpunkten (182,2 cm−1) implementiert, der Quantilwert ist auf 10 % eingestellt. Die Rauschreduzierung wurde mithilfe eines Savitsky-Goley-Filters mit den folgenden Parameterwerten implementiert: Die Ordnung des Polynoms war gleich 1, die Breite des gleitenden Spektralfensters betrug 45 Spektralpunkte (41 cm−1). Die Ermittlung der optimalen Filterparameter wurde auf folgende Weise geschätzt. Die zufällige Natur des Rauschens ermöglicht es uns, das durchschnittliche Raman-Spektrum \({\overline{S} }_{samp}\) eines experimentellen Stichprobensatzes von \({S}_{samp,i}\)-Spektren zu betrachten:

als Annäherung an das tatsächliche Spektrum ohne Rauschen. Dabei ist \(N\) das Volumen des Versuchssatzes. Bezeichnen wir das vom Savitsky-Goley-Filter verarbeitete Raman-Spektrum \({S}_{samp,i}(k)\) als \({S}_{SG,i}\left(k\right),\) wobei \(k=\stackrel{-}{1,K}\) ist die Raman-Verschiebung. Optimale Filterparameter entsprechen dem Minimum der folgenden Funktion r (siehe Gleichung (9)):

Die Abhängigkeit von \(\mathrm{r}\) von der gleitenden Spektralfensterbreite ist in Abb. 12 dargestellt. Hier haben wir das Polynom erster Ordnung im Savitsky-Goley-Filter verwendet. Im Allgemeinen ist die Wahl der Gleitfensterbreite von etwa 40 cm−1 durchaus sinnvoll. Die Verwendung von Polynomen höherer Ordnung verringert die Qualität der Filterung (siehe Abb. 13), da ein geringerer \(\mathrm{r}\)-Wert einer näheren Form eines durch den Savitsky-Goley-Filter verarbeiteten Raman-Spektrums einem durchschnittlichen Raman-Spektrum von entspricht den jeweiligen experimentellen Probensatz.

Die Abhängigkeit von \(\mathrm{r}\) vom gleitenden Spektralfenster für Raman-Spektren von Blut auf verschiedenen Substraten, verarbeitet durch Savitsky-Goley-Filter (a), und dasselbe für reine Substrate (b). Hier wurde in dieser Filterimplementierung das Polynom erster Ordnung verwendet. Der Parameter „Framelen“ bedeutet hier das gleitende Spektralfenster.

Die Abhängigkeit von \(\mathrm{r}\) von der Polynomordnung für Raman-Spektren von Blut auf Al-Substrat (a), blauem Polyestersubstrat (b) und reinem blauem Polyestersubstrat (c), Verarbeitung durch Savitsky-Goley-Filter. Hier bedeutet der Parameter „Framelen“ das gleitende Spektralfenster, „Ordnung“ ist die Ordnung des im Savitsky-Goley-Filter verwendeten Polynoms.

Der typische Signal-Rausch-Wert der Raman-Spektren in der Nähe ihrer Maxima betrug etwa 62 dB, der Mittelwert dieses Parameters lag bei etwa 7 dB, was auf das Vorhandensein vieler kleiner Peaks zurückzuführen ist.

Es werden die Ergebnisse einer vergleichenden Studie zweier Methoden zum Nachweis von Körperflüssigkeitsspuren auf gängigen Substraten vorgestellt. Die erste Methode, MCRAD genannt, ist ein Standard in der Raman-Spektroskopie, der die multivariate Kurvenauflösung mit der Additionsmethode kombiniert. Eine andere als RSC bezeichnete Methode ist neu in Anwendungen der Raman-Spektroskopie und basiert auf der Reduzierung der Spektrumkomplexität, wenn wir eine Spektralkomponente vollständig aus einer Mischung entfernen. Beide Methoden implementieren den „Einer-pro-Schritt“-Ansatz für die Zerlegung komplexer Raman-Spektren von Proben. Es wurde ein Beispiel für die Erkennung von Blutflecken auf blauen Polyester-, Denim-, Baumwollstoff- und weißen Polyestersubstraten betrachtet.

Es wurde gezeigt, dass sowohl RSC als auch MCRAD die Wiederherstellung eines Volumenanteils einer Zielkomponente (Körperflüssigkeit) aus einem experimentellen Spektrum dieser auf einem interferierenden Substrat getrockneten Körperflüssigkeit mit nur vorheriger Kenntnis dieses Körperflüssigkeits-Etalon-Spektrums ermöglichen. RSC zeigt eine zuverlässigere Leistung als MCRAD bei der Erkennung und Identifizierung eines Blutflecks auf störenden Substraten. In komplizierten Fällen ist die Wahrscheinlichkeit, ein falsches Ergebnis zu erhalten, bei MCRAD wesentlich höher als bei RSC. Diese Schlussfolgerung wird durch die Ergebnisse der Zerlegung der Raman-Spektren von Blutflecken auf verschiedenen Substraten bestätigt (siehe Abb. 3 und Tabelle 1). Unserer Meinung nach ist die bessere Robustheit von RSC im Vergleich zu MCRAD auf die Implementierung der Ergodentheorie in der Zielminimierungsfunktion in der RSC-Methode zurückzuführen.

Wenn ein Substrat im Vergleich zu einer Körperflüssigkeit ein ziemlich einzigartiges Raman-Spektrum aufweist, sind sowohl RSC als auch MCRAD sehr effizient bei der Vermeidung falsch positiver Ergebnisse. In komplizierten Fällen eines Substrats, bei dem das Raman-Spektrum im Vergleich zur getesteten Körperflüssigkeit eine geringe Spezifität (mit anderen Worten eine hohe Ähnlichkeit) aufweist, kann die Höhe dieser Fehler bis zu 0,2 Volumenanteile anstelle des Nullwerts betragen. Solche Situationen traten bei MCRAD häufiger auf als bei RSC (siehe Abb. 4). Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir den Soergel-Abstand, um die Ähnlichkeit zweier Spektren quantitativ abzuschätzen, die vorab über ein gleitendes Spektralfenster gemittelt wurden. Die berechneten Abhängigkeiten des Soergel-Abstands zwischen zwei Raman-Spektren von der Größe des Spektralfensters weisen offensichtliche Besonderheiten für den Denim-Fall auf, der die größte Verzerrung in den Zerlegungsergebnissen darstellte. Für die praktische Anwendung der entwickelten Methode haben wir einen einfachen zusätzlichen Test (hierarchischer Ansatz) für ein potenziell falsch positives Ergebnis unter Verwendung von Raman-Spektren eines reinen Substrats vorgeschlagen und diese statistisch mit Raman-Spektren verglichen, die für den scheinbaren Blutfleck erhalten wurden.

Daher bietet diese Arbeit einen neuartigen Ansatz in der Raman-Spektroskopie namens RSC zur Lösung eines der anspruchsvollsten Probleme bei der Identifizierung von Blutflecken für forensische Zwecke mithilfe der Raman-Spektroskopie, nämlich der Interferenz gemeinsamer Substrate.

Einige Kommentare für zukünftige Studien lauten wie folgt. Der Ursprung etablierter Besonderheiten in Abhängigkeiten des Soergel-Abstands zwischen zwei Raman-Spektren von der Größe des Spektralfensters sollte im Detail untersucht werden. Wir berichten nicht über die Empfindlichkeit der RSC-Methode. Die Nachweisgrenze der Methode muss untersucht werden, verglichen mit den aktuellen Methoden der Strafverfolgungsbehörden und den Anforderungen der praktischen Anwendung (z. B. für DNA-Profiling).

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss gemäß dem Dekret der Regierung der Russischen Föderation Nr. 220 vom 9. April 2010 (Vereinbarung Nr. 075-15-2021-615 vom 4. Juni 2021) und der National Science Foundation, USA, unter der Zuschuss-Nr . 2052030 (IKL).

Labor für molekulare Laserbildgebung und maschinelles Lernen, Staatliche Universität Tomsk, Lenin Avenue 36, Tomsk, Russland, 634050

Yury V. Kistenev, Alexei V. Borisov und Alisa A. Samarinova

Fachbereich Chemie, University at Albany, SUNY, 1400 Washington Avenue, Albany, NY, 12222, USA

Sonivette Columbus-Rodriguez & Igor K. Lednev

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Konzeptualisierung, YVK und IKL; Methodik, AVB; Software, AVB; Untersuchung, SCR und AVB; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, YVK, SCR, AAS, IKL und AVB; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, YVK und IKL; Visualisierung, AVB; Betreuung, YVK und IKL Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Yury V. Kistenev oder Igor K. Lednev.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kistenev, YV, Borisov, AV, Samarinova, AA et al. Eine neuartige Raman-spektroskopische Methode zum Nachweis von Blutspuren auf einem störenden Substrat. Sci Rep 13, 5384 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31918-9

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Eingegangen: 25. Oktober 2022

Angenommen: 20. März 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31918-9

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