Kreuzen

Aug 21, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11506 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die rasche Einbürgerung von Bombus terrestris auf der Nemuro-Halbinsel hat zu einem Rückgang zweier eng verwandter einheimischer japanischer Arten geführt, nämlich Bombus hypocrita sapporensis und Bombus cryptarum florilegus, die beide zur gemeinsamen Untergattung Bombus gehören. Obwohl allgemein angenommen wird, dass die Kreuzung einheimischer und nicht heimischer Arten durch das in dieser Region verbreitete männliche Sexualpheromon beeinflusst wird, wurde keine Studie durchgeführt, um diese Behauptung zu untermauern. Daher untersuchten wir die Kreuzaktivitäten männlicher Sexualpheromone zwischen einheimischen und nicht heimischen Hummeln sowie die Häufigkeit von Kreuzpaarungen mithilfe chemischer und DNA-Assays. Unsere Gaschromatographie-Elektroantennographie-Detektoranalysen und Verhaltenstests ergaben das Vorhandensein sexueller Pheromon-Kreuzaktivitäten zwischen B. terrestris und den beiden japanischen Hummelarten. Darüber hinaus ergaben DNA-Analysen, dass es auf der Nemuro-Halbinsel zu Kreuzpaarungen zwischen einheimischen und nicht-heimischen Arten kam. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf die unmittelbare Notwendigkeit von Schutzmaßnahmen zum Schutz der japanischen Hummelpopulationen auf der Nemuro-Halbinsel hin.

Seit die importierte Hummel Bombus terrestris L. 2006 in Japan als gebietsfremde Art eingestuft wurde, stellt sie vor große Herausforderungen. Obwohl B. terrestris als wichtiger Gewächshausbestäuber dient, haben entflohene Königinnen und Männchen in Hokkaido, Japan, wilde Populationen etabliert. Dieser Einbürgerungsprozess hat zu einer Konkurrenz zwischen B. terrestris und einheimischen japanischen Hummelarten, zur Störung der symbiotischen Beziehungen zwischen einheimischen Pflanzen und Hummeln und zur Einführung neuer Schädlinge und Krankheitserreger geführt1,2,3,4,5,6,7,8 .

Unter Laborbedingungen wurde eine Hybridisierung zwischen B. terrestris und eng verwandten japanischen Hummelarten wie B. hypocrita hypocrita, B. h. sapporensis und B. ignitus kommen leicht vor9. Es entstehen jedoch keine lebensfähigen Hybriden, wenn einheimische Königinnen sich mit Männchen von B. terrestris paaren, da die gelegten Eier die Embryonalentwicklung stoppen10,11. Dennoch wirkt sich die Kreuzung zwischen diesen Arten nachteilig auf die Fortpflanzung einheimischer Hummeln aus, da sich Bombus-Königinnen typischerweise nur ein- oder zweimal paaren12. Darüber hinaus ergab eine frühere DNA-Analyse das Vorhandensein von B. terrestris-Spermatozoen in den Spermatheken wilder Königinnen von B. h. Heuchler, B. h. sapporensis und B. ignitus, was darauf hindeutet, dass es auf dem Feld zu einer Kreuzung zwischen B. terrestris-Männchen und einheimischen Königinnen kommt11. Unsere frühere Studie legte auch nahe, dass die Kreuzpaarung durch die Ähnlichkeiten in der männlichen Sexualpheromonproduktion in der Labialdrüse (LG) erleichtert wird13.

Die Nemuro-Halbinsel im Osten von Hokkaido stellt einen wertvollen Lebensraum für einheimische Hummeln dar. Zehn von 15 japanischen Arten, darunter die seltene Hummelart B. cryptarum florilegus, gedeihen in dieser Region14. Tatsächlich, B. c. Florilegus weist eine eingeschränkte Verbreitung auf, kommt nur auf den Halbinseln Nemuro und Notsuke in Japan vor und wird in der Roten Liste Japans als nahezu gefährdete Art aufgeführt14. Da sich B. terrestris in dieser Region eingebürgert hat, sind die Populationen von B. h. sapporensis und B. c. Florilegus sind stetig zurückgegangen15. Obwohl allgemein angenommen wird, dass die Kreuzpaarung zwischen einheimischen und nicht heimischen Arten durch das in der Region verbreitete männliche Sexualpheromon beeinflusst wird, gibt es keine empirischen Beweise, die diese Hypothese stützen. Daher untersuchten wir mithilfe chemischer und DNA-Assays die Häufigkeit von Kreuzpaarungen und die Kreuzaktivitäten männlicher Sexualpheromone zwischen einheimischen und nichtheimischen Hummeln.

Frühere Gaschromatographie-Elektroantennographie-Detektoranalysen (GC-EAD) bestätigten das Vorhandensein von Ethyldodecanoat, 2,3-Dihydrofarnesal und 2,3-Dihydrofarnesol, die von der männlichen LG in B. terrestris emittiert wurden16. Darüber hinaus wurde Ethyldodecanoat in der männlichen LG von B. h. nachgewiesen. sapporensis13. Unsere GC-EAD-Analysen bestätigten, dass die männliche LG von B. c. Florilegus gibt Ethyldodecanoat ab. Darüber hinaus lösten Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol bei jungfräulichen Königinnen von B. terrestris deutliche elektrophysiologische Antennenreaktionen aus (Abb. 1Aa). Allerdings rief nur Ethyldodecanoat bei B. h. deutliche elektrophysiologische Antennenreaktionen hervor. sapporensis und B. c. florilegus jungfräuliche Königinnen (Abb. 1Ab, Ac, Ba, Bb, Bc, Ca, Cb, Cc).

Gleichzeitige Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektor- und elektroantennographische Detektoraufzeichnungen von (a) Bombus terrestris, (b) B. hypocrita sapporensis und (c) jungfräulichen Königinnen von B. cryptarum florilegus unter Verwendung flüchtiger Stoffe, die aus der männlichen Labialdrüse (LG) von (A ) B. terrestris, (B) B. h. sapporensis und (C) B. c. Florilegus. Identifizierte Verbindungen: (1) Ethyldodecanoat; (2) 2,3-Dihydrofarnesal; und (3) 2,3-Dihydrofarnesol.

Die binomiale Testanalyse von Verhaltenstests, die mit einem Y-Röhren-Olfaktometer durchgeführt wurden, ergab, dass B. terrestris-Königinnen (n = 20) eine signifikante (P < 0,05) Präferenz für BtL (P = 0,000067), BhsL (P = 0,023103), BcfL ( P = 0,044357), ED (P = 0,00109), DF (P = 0,000067) und EFM (P = 0,000067) gegenüber Pentan (Abb. 2). In ähnlicher Weise hat B. h. basierend auf der Binomialtestanalyse festgestellt, dass B. h. Sapporensis-Königinnen zeigten eine signifikante (P < 0,05) Präferenz für BtL (P = 0,041656, n = 15), BhsL (P = 0,000214, n = 15), BcfL (P = 0,000366, n = 14) und ED (P = 0,001221). , n = 12) und EFM (P = 0,034912, n = 13) über Pentan (Abb. 3). Ebenso ergab die Binomialtestanalyse, dass B. c. Florilegus-Königinnen (n = 10) zeigten eine signifikante (P < 0,05) Präferenz für BtL (P = 0,017578), BhsL (P = 0,006836), BcfL (P = 0,006836), ED (P = 0,006836) und EFM (P =). 0,043945) über Pentan (Abb. 4). Allerdings weder B. h. sapporensis (n = 11) noch B. c. Florilegus-Königinnen (n = 10) zeigten im Vergleich zu Pentan eine Anziehung oder Abstoßung von DF (Binomialtest, P = 0,225586 bzw. P = 0,246094) (Abb. 3 und 4). Darüber hinaus sind B. terrestris (n = 20), B. h. sapporensis (n = 15) und B. c. Florilegus-Königinnen (n = 10) zeigten im Vergleich zu einer leeren Kontrolle keine Anziehung oder Abstoßung von Pentan (Binomialtest, P = 0,160179, P = 0,196381 bzw. P = 0,205078) (Abb. 2, 3 und 4).

Attraktivität der Lippendrüsenextraktdüfte (LG) aus Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) und B. c. Florilegus (BcfL) sowie Ethyldodecanoat (ED), 2,3-Dihydrofarnesol (DF) und eine Mischung aus Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol (EFM) gegen das Lösungsmittel Pentan (Pe) und eine leere Kontrolle (E) in Bombus terrestris jungfräuliche Königinnen. Die Y-Achse gibt die Anzahl der Personen an, die innerhalb von 5 Minuten jeden Duft auswählen. Sternchen geben die statistische Signifikanz (P < 0,05) an, die durch Binomialtests ermittelt wurde.

Attraktivität von Düften aus Labialdrüsenextrakten (LG) aus Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) und B. c. Florilegus (BcfL) sowie Ethyldodecanoat (ED), 2,3-Dihydrofarnesol (DF) und eine Mischung aus Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol (EFM) gegen das Lösungsmittel Pentan (Pe) und eine leere Kontrolle (E) in B. h. Sapporensis jungfräuliche Königinnen. Die Y-Achse gibt die Anzahl der Personen an, die innerhalb von 5 Minuten einen der beiden Düfte gewählt haben. Sternchen geben die statistische Signifikanz (P < 0,05) an, die durch Binomialtests ermittelt wurde.

Attraktivität von Düften aus Labialdrüsenextrakten (LG) aus Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) und B. c. Florilegus (BcfL) sowie Ethyldodecanoat (ED), 2,3-Dihydrofarnesol (DF) und eine Mischung aus Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol (EFM) gegen das Lösungsmittel Pentan (Pe) und eine leere Kontrolle (E) in B. c. Florilegus jungfräuliche Königinnen. Die Y-Achse gibt die Anzahl der Personen an, die innerhalb von 5 Minuten einen der beiden Düfte gewählt haben. Sternchen geben die statistische Signifikanz (P < 0,05) an, die durch Binomialtests ermittelt wurde.

Es wurde festgestellt, dass die mitochondrialen DNA-Gensequenzen der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I (COXI), die aus der von Spermien stammenden DNA extrahiert wurden, zu 100 % mit den Sequenzen übereinstimmen, die für jede der drei Arten in der DNA-Datenbank Japans registriert sind (LC695022, LC695025 und LC695021). Es ist uns gelungen, die ITS2-Region der drei Hummelarten zu entschlüsseln, die artspezifische Mutationen aufwiesen. Die ITS2-Sequenzen dieser Arten wurden in der DNA-Datenbank Japans (LC769002–LC769004) registriert. Bemerkenswert ist, dass die ITS2-Sequenzen, die aus Spermien-DNA in den Spermatheken mehrerer Königinnen gewonnen wurden, eine unterschiedliche Artidentifizierung zeigten. Die Identifizierung kreuzpaarender Königinnen anhand der ITS2-Region stimmte mit den Ergebnissen der mitochondrialen DNA-Analyse überein.

Die Ergebnisse der artspezifischen Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Sequenzanalyse stimmten überein und zeigten, dass 9,9 % von B. c. Florilegus-Königinnen auf der Nemuro-Halbinsel wurden von eindringenden B. terrestris-Männchen besamt. Darüber hinaus sind 4,4 % von B. h. Sapporensis-Königinnen speicherten Sperma von B. terrestris-Männchen in ihren Spermatheken. Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine Kreuzung zwischen B. terrestris-Königinnen und den Männchen einheimischer Arten. Durch Präparation bestätigten wir das Fehlen männlicher Spermien in den Spermatheken einiger Königinnen der drei Arten. Die Häufigkeit unbegatteter Königinnen betrug 13,5 %, 2,8 % und 2,8 % für B. c. florilegus, B. h. sapporensis bzw. B. terrestris (Tabelle 1).

Wir beobachteten überwickelte Doppelpeaks in den Chromatogrammen der mitochondrialen DNA-COXI-Gensequenzen nur in den DNA-Proben, die aus den Spermatheken von B. h. extrahiert wurden. Sapporensis-Königinnen. Diagnostische PCR-Analysen dieser Proben ergaben, dass 1,6 % der Spermatheken in B. h. sapporensis-Königinnen enthielten DNA sowohl von B. h. sapporensis und B. terrestris (Tabelle 1 und Abb. 5).

(a) Elektrophoretisches Gelbild von PCR-Produkten unter Verwendung gemeinsamer (1) und spezifischer Primer (2–5) für Bombus cryptarum florilegus und B. terrestris. Das Gel zeigt den DNA-Marker (M), DNA-Proben vom Bein (1 und 2) und Spermatheca (3 und 4) von B. cf-Königinnen sowie DNA-Proben von den Beinen von B. terrestris-Königinnen (5) (Spermatheca besamt). durch männliches Artgenossen 3 und Spermatheca, besamt durch allospezifisches B. terrestris-Männchen 4). (b) Elektrophoretisches Gelbild von PCR-Produkten unter Verwendung gemeinsamer (6) und spezifischer Primer (7–11) für B. hypocrita sapporensis und B. terrestris. Das Gel zeigt den DNA-Marker (M), DNA-Proben aus den Beinen (6 und 7) und Spermatheca (7–10) von B. hs-Königinnen sowie DNA-Proben aus den Beinen von B. terrestris-Königinnen (11) (Spermatheca besamt). von artgleichen Männchen 8, von artgleichen und allospezifischen B. terrestris-Männchen befruchtete Spermatheca 9 und von allospezifischen B. terrestris-Männchen befruchtete Spermatheca 10). (c) Elektrophoretisches Gelbild von PCR-Produkten unter Verwendung gemeinsamer (12) und spezifischer Primer (13 und 14) für B. terrestris. Das Gel zeigt den DNA-Marker (M) sowie DNA-Proben aus den Beinen (12 und 13) und Spermatheken (14) von B. terrestris-Königinnen.

Unsere GC-EAD-Analysen und Verhaltenstests lieferten Hinweise auf Kreuzaktivitäten in Sexualpheromonen zwischen B. terrestris und zwei einheimischen japanischen Hummelarten, B. h. sapporensis und B. c. Florilegus. Die Attraktivität von Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol für jungfräuliche B. terrestris-Königinnen und nur Ethyldodecanoat für B. terrestris, B. h. sapporensis und B. c. Florilegus-Königinnen, wurde demonstriert. Das Markieren von Duftstoffen mit Geruchsstoffen, die vom Kopfteil des LG erzeugt werden, ist bei männlichen Hummeln ein häufiges Verhalten, um Artgenossen anzulocken17,18. Jede Hummelart verfügt über eine eigene artspezifische Mischung geruchsmarkierender Komponenten19. Allerdings wird davon ausgegangen, dass Duftmarkerpheromone eine Rolle bei der reproduktiven Isolierung spielen und dass das gemeinsame Vorhandensein von Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol in der LG im besten Fall zu Kreuzpaarungen zwischen einheimischen und nicht heimischen Arten führt13 Nach unserem Kenntnisstand ist die vorliegende Studie die erste, die ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Königinnen zeigt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich entkommene B. terrestris-Männchen mit jungfräulichen Königinnen einheimischer Arten in Nemuro, Hokkaido, Japan, paaren, was darauf hindeutet, dass die Ähnlichkeit der männlichen Sexualpheromone zwischen einheimischen und nichtheimischen Hummeln ein Schlüsselfaktor bei der Kreuzverpaarung auf dem Feld ist. Obwohl ein häufig vorkommendes Sexualpheromon auf die Möglichkeit einer Kreuzpaarung zwischen B. h. sapporensis und B. c. florilegus wurde in dieser Studie keine Kreuzpaarung zwischen einheimischen Hummeln beobachtet. Wir spekulieren, dass sich die jungfräulichen Königinnen und Männchen der beiden einheimischen Hummelarten aufgrund unterschiedlicher Fortpflanzungszeiten und -strategien selten auf dem Feld begegnen.

DNA-Analysen bestätigten das Vorkommen von Kreuzpaarungen zwischen einheimischen und nicht heimischen Arten auf der Nemuro-Halbinsel. Dies kann auf eine Kontamination der DNA-Probe oder die Möglichkeit einer Befruchtung der Königinnen durch B. h. zurückgeführt werden. sapporensis und B. terrestris Männchen. Obwohl gemäßigtes B. c. Florilegus-Königinnen sind monandrisch12, B. h. sapporensis und B. terrestris zeigen in Japan sowohl monandrisches als auch polyandrisches Verhalten20. Es wurde berichtet, dass 34,0 % von B. h. Sapporensis-Königinnen sind polyandrisch. Interessanterweise paarten sich einheimische Hummelmännchen nicht mit B. terrestris-Königinnen, was möglicherweise auf die territoriale Dominanz der B. terrestris-Männchen während des Vorpaarungsverhaltens mit Geruchsmarkierung zurückzuführen ist17,18. Diese Störung der Fortpflanzung führt wahrscheinlich zu einem Rückgang der einheimischen Hummelpopulationen, da einheimische Königinnen, die sich mit B. terrestris paaren, aufgrund der gestoppten Embryonalentwicklung der gelegten Eier keine lebensfähigen Nachkommen hervorbringen10,11.

Der Rückgang einheimischer Hummelpopulationen in Japan, insbesondere der von B. h. sapporensis und B. c. florilegus hat aufgrund der raschen Einbürgerung von B. terrestris zugenommen, was zu einer Verschlechterung des Lebensraums und der Fragmentierung von B. c. Florilegus-Populationen15. Tatsächlich hat eine aktuelle Studie die fragmentierte Population und die verringerte genetische Vielfalt von B. c. hervorgehoben. Florilegus auf den Halbinseln Nemuro und Notsuke14. Diese Erkenntnisse unterstreichen zusammen mit unseren Ergebnissen die Notwendigkeit sofortiger Erhaltungsmaßnahmen zum Schutz einheimischer Hummeln auf der Nemuro-Halbinsel. Darüber hinaus sollten zukünftige Studien Kontrollmethoden für wildes B. terrestris berücksichtigen.

Jungfräuliche Königinnen und Männchen von B. h. sapporensis und B. c. Florilegus wurden aus im Labor gezüchteten Kolonien gewonnen, sofern nicht anders angegeben. Diese Kolonien wurden unter Verwendung begatteter Königinnen gegründet, die zwischen Juni 2011 und 2012 auf der Nemuro-Halbinsel auf der japanischen Insel Hokkaido gesammelt wurden (Abb. 6). Zusätzlich wurde eine kommerzielle Kolonie von B. terrestris L. von Agrisect Inc. (Inashiki, Ibaraki, Japan) erworben. Alle Kolonien wurden in einem klimatisierten Raum bei 28 °C und konstanter Dunkelheit mit einer Nahrung aus Pollen und einer 55 %igen Zuckerlösung aufgezogen. Elektrophysiologische Analysen und Verhaltenstests wurden an 7 Tage alten Männchen und 7–11 Tage alten neuen Königinnen durchgeführt.

Verbreitungskarte der Probenahmestellen der Bombus-Arten in Japan (a). Bombus cryptarum florilegus (bcf) ist nur auf den Halbinseln Nemuro und Notsuke (c) verbreitet, markiert durch gestrichelte Linien. Bombus hypocrita sapporensis (bhs) ist auf der gesamten Insel Hokkaido (b) verbreitet, was durch weiße und graue Schattierungen angezeigt wird. Bombus terrestris (bt) ist weit verbreitet und wird auf der gesamten Insel Hokkaido eingebürgert, was durch die graue Schattierung angezeigt wird. Der gestrichelte Bereich stellt die überlappenden Verbreitungsgebiete von drei Bombus-Arten dar. Karte erstellt mit der Testversion von Vactor (Geospatial Information Authority of Japan), https://maps.gsi.go.jp/vector/.

Zwischen 2009 und 2019 wurden 641 Königinnen von B. c. florilegus, B. h. sapporensis und B. terrestris wurden auf der Nemuro-Halbinsel, Insel Hokkaido, Japan, gesammelt (Abb. 6). Die Sammeldetails sind in Tabelle 1 aufgeführt. Für die DNA-Analyse wurden die Königinnen in 99 % Ethanol konserviert und bei –20 °C gelagert.

Die Probenvorbereitung für die Analyse männlicher Sexualpheromone erfolgte nach der in unserer vorherigen Studie13 beschriebenen Methode. Männliche Hummeln wurden vor der chemischen Analyse und Sektion bei –40 °C eingefroren, um LGs aus dem Kopf zu gewinnen. Die LGs wurden in 4-ml-Fläschchen gegeben, die mit Aluminiumfolie verschlossen waren. Flüchtige Bestandteile wurden aus den zerkleinerten LGs mithilfe einer 10-minütigen Festphasen-Mikroextraktions-Headspace-Probenahme (SPME) extrahiert. Das SPME-Gerät (SUPELCO; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) enthielt eine mit Polydimethylsiloxan beschichtete Quarzglasfaser (100 µm Dicke).

Die Aufzeichnungstechnik für Antennenreaktionen folgte unserer vorherigen Studie21. Das GC-EAD-System (TAIYO Co., Tsukuba, Japan) wurde verwendet, um die Antennenreaktionen von B. terrestris, B. h. sapporensis und B. c. florilegus jungfräuliche Königinnen bis hin zu Extrakten aus den männlichen LGs artspezifischer und allospezifischer Individuen. Flüchtige Stoffe wurden mithilfe einer DB-5MS-Säule, die mit einem GC-7890A-System (Agilent Technologies, USA) ausgestattet war, nachgewiesen und getrennt. Die Säulentemperatur wurde zunächst auf 120 °C eingestellt und dann mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min auf 250 °C erhöht. Der Heliumfluss (6,5 ml/min) wurde in einem Splitless-Injektoranschluss (250 °C) verwendet, und ein Flammenionisationsdetektoranschluss (300 °C) wurde mit einer Kombination aus Wasserstoffgas und Luftfluss (30 ml/min und 400 ml/min) verwendet bzw. ml/min).

Mit leitfähigem Gel gefüllte Silberelektroden (Aquasonic; Parker Laboratories, USA) wurden an einen Verstärker angeschlossen. Mit einer Pinzette wurden den lebenden neuen Königinnen Antennen entnommen und zwischen den Silberelektroden positioniert. Jede Analyse wurde fünfmal wiederholt. Verbindungen, die Reaktionen in den Antennen hervorriefen, galten als EAD-aktive Verbindungen.

Um die EAD-aktiven Verbindungen zu identifizieren, wurden LG-Extrakte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie nach der gleichen Methode wie bei GC-EAD-Analysen analysiert. Erkannte Peaks wurden mit der Massenspektrendatenbank (Wiley 229) verglichen und vermutete Verbindungen wurden durch Vergleich von Retentionszeiten und Massenspektren mit den jeweiligen chemischen Standards identifiziert: 97 % Ethyldodecanoat (Sigma-Aldrich) und 97 % 2,3-Dihydrofarnesol ( TAIYO Co.). Die Identifizierung von 2,3-Dihydrofarnesal basierte auf einem Vergleich der erhaltenen Massenspektren mit denen in der Wiley-Bibliothek und zuvor veröffentlichten Daten16.

Bioassays von Hummelköniginnen, die zur Beurteilung ihrer Reaktion auf konspezifische oder allospezifische männliche LG-Extrakte verwendet wurden, folgten den zuvor beschriebenen Methoden21,22. Im Verhaltensexperiment wurde ein Y-Röhren-Olfaktometer verwendet, das aus einem einzelnen langen Arm (Länge 35,0 cm; Durchmesser 3,5 cm) und zwei kurzen Armen (Länge 15,0 cm; Durchmesser 3,5 cm) bestand. Glaszylinder (Länge 10,0 cm; Durchmesser 2,5 cm), die die Testsubstanzen enthielten, wurden mit einem Silikonschlauch an das Ende der kürzeren Arme angeschlossen. Zu den Testsubstanzen gehörten 2 μL 0,001 % Ethyldodecanoat (ED), 2,3-Dihydrofarnesol (DF), eine Mischung aus Ethyldodecanoat und 2,3-Dihydrofarnesol (EFM), gelöst in Pentan, sowie LG-Extrakte von B. terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL), B. c. Florilegus (BcfL) und Pentan allein. Diese Substanzen wurden auf ein Stück Filterpapier im Glaszylinder aufgetragen. Die LG-Extrakte wurden durch 20-minütiges Eintauchen männlicher LGs in 1 ml Pentan erhalten. Beide Glaszylinder waren über gleich lange Silikonschläuche mit einer Luftpumpe verbunden, wobei durch einen einzigen Einlass Luft mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min in jeden Zylinder gedrückt wurde.

Insgesamt 20, 16 und 10 jungfräuliche Königinnen von B. terrestris, B. h. sapporensis und B. c. Florilegus wurden jeweils in die Bioassays einbezogen. Jede Königin wurde in eine Plastikkammer (15 × 10 × 10 cm) entlassen, die mit dem langen Arm des Y-Rohrs verbunden war. Wenn eine Biene innerhalb von 5 Minuten einen der kürzeren Arme wählte, wurde davon ausgegangen, dass sie den entsprechenden Duftstoff „ausgewählt“ hatte. Bienen, die innerhalb dieses Zeitraums keine Wahl trafen, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Die experimentelle Sequenz bestand aus der Wahl zwischen leerem (E) vs. Pentan, gefolgt von BtL vs. Pentan, BhsL vs. Pentan, BcfL vs. Pentan, ED vs. Pentan, DF vs. Pentan und EFM vs. Pentan. Um eine mögliche Verzerrung hin zu einem bestimmten Arm des Y-Rohrs zu verhindern, wurden die Positionen der Behandlung (BtL, BhsL, BcfL, ED, DF und EFM) und der Kontrolle (Pentan) nach jedem Lauf geändert. Der Aufbau des Y-Röhrengeräts ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt.

Die aus dem Y-Tube-Experiment erhaltenen Daten wurden mithilfe des Binomialtests analysiert. P-Werte für mehrere Vergleiche wurden mit der Holm-Methode korrigiert.

Genomische DNA von Königinnen wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) aus den Hinterbeinen extrahiert. In den Spermatheken von Königinnen vorhandenes Sperma wurde wie zuvor beschrieben23 gesammelt und verarbeitet. Spermatheken wurden in 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung präpariert und Spermienklumpen mithilfe von Insektenstiften von den Membranen getrennt. Aus diesen Spermienklumpen wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) genomische DNA des Männchens extrahiert, das sich mit einer Königin paarte.

Fragmente des mitochondrialen COXI-Gens, das üblicherweise als DNA-Barcode-Region verwendet wird, wurden über PCR unter Verwendung des Primerpaars COIF (HCO2198_t1: 5ʹ-TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3ʹ) und COIR (LCO1490_t1: 5ʹ-CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3ʹ) amplifiziert )24. Die PCR-Amplifikationen bestanden aus einem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 98 °C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 Sekunden, Annealing bei 50 °C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten. ExTaq-DNA-Polymerase (Takara, Otsu, Japan) wurde für Amplifikationen in einem Thermocycler (Takara) verwendet. PCR-Produkte wurden mit ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH) gereinigt. Zyklussequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung beider Primer und BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems) durchgeführt. Nach der Produktreinigung wurde die Sequenzierung mit einem ABI 3130xl-Sequenziergerät (Applied Biosystems) durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Programm GENETYX (GENETYX, Tokio, Japan) abgeglichen und zur Homologieanalyse wurde eine BLAST-Suche durchgeführt.

Interspezifische Kopulation zwischen B. c. florilegus, B. h. sapporensis und B. terrestris wurde durch PCR und Elektrophorese bestätigt. Die diagnostische PCR wurde unter Verwendung allgemeiner und artspezifischer Primer von Bumblebee durchgeführt, die auf der Grundlage der COI-Gensequenzen von B. c. florilegus, B. h. sapporensis bzw. B. terrestris25 (Tabelle 2). Das universelle Primerpaar für die DNA-Barkodierung24 diente als Positivkontrolle für die DNA-Qualitätsbewertung. Die in der Sequenzanalyse verwendete DNA diente als Template-DNA. Die PCR wurde unter Verwendung der folgenden Zyklusparameter durchgeführt: ein anfänglicher Denaturierungsschritt von 2 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 50–58 °C und 60 Sekunden bei 72 °C. Der letzte Elongationsschritt wurde auf 10 Minuten verlängert. HiDi-DNA-Polymerase (myPOLS Biotec, Konstanz, Deutschland) wurde in einem Thermocycler (Takara) verwendet. Die PCR-Produkte wurden auf 4 % PrimeGel™ Agarose PCR-Sieve-Agarosegelen (Takara) einer Elektrophorese unterzogen und unter ultraviolettem Licht unter Verwendung einer Midorigreen Direct DNA Stain-Lösung (NIPPON Genetics, Tokio, Japan) sichtbar gemacht.

Um das Vorhandensein interspezifischer Paarungsköniginnen festzustellen, haben wir auch die nukleare DNA-ITS2-Region sequenziert. Es wurden zufällig ausgewählte Königinnen analysiert, bei denen anhand der diagnostischen PCR für mitochondriale DNA festgestellt wurde, dass sie eine interspezifische Paarung durchlaufen hatten, sowie 20 Königinnen pro Art, bei denen eine intraspezifische Paarung festgestellt wurde. Die ITS2-Region wurde unter Verwendung von zwei Primern und experimentellen Bedingungen sequenziert, die zuvor entwickelt wurden26. Die ITS2-Sequenzlängen von B. h. sapporensis, B. c. florilegus und B. terrestris waren etwa 2000 bp groß. Die PCR-Fragmente wurden in einen pUC19-Vektor ligiert und in kompetente Escherichia coli JM109-Zellen (Takara, Otsu, Japan) transformiert. Insgesamt wurden 360 rekombinante Kolonien ausgewählt und einzeln in 20 μl TE-Puffer suspendiert. Die Inserts wurden durch PCR unter Verwendung der Primer M13-RV und M13–47 für die Multiklonierungsstelle von pUC19 (Takara, Otsu, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Für die Sequenzierung wurden drei diesen Hummeln gemeinsame interne Primer entwickelt (BombusITS2_588: 5ʹ-GCAGGTTTTCGATGAGCACG-3ʹ; BombusITS2_1103: 5ʹ-ACGTTCGTCGGAAATCGTAC-3ʹ; BombusITS2_1474: 5ʹ-GTTGGTCATCCCATGCCTTT-3ʹ). Die Sequenzierungsanalysemethode war die gleiche wie die, die für die Sequenzierung des mitochondrialen DNA-COXI-Gens verwendet wurde, wie oben beschrieben.

Mitochondriale DNA-Sequenzen von drei Bombus-Arten sind in der DNA-Datenbank Japans verfügbar: Bombus cryptarum: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695021/?filetype=html; Bombus hypocrita: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695025/?filetype=html; Bombus terrestris: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695022/?filetype=html. Darüber hinaus sind nukleare DNA-ITS2-Sequenzen von drei Bombus-Arten in der DNA-Datenbank von Japan verfügbar: Bombus cryptarum: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769002/?filetype=html; Bombus hypocrita: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769003/?filetype=html; Bombus terrestris: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769004/?filetype=html.

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Yuine Asanuma, Erina Fujimoto, Hisashi Okuyama und Jun-ichi Takahashi

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RK, YA und JT haben den Hauptmanuskripttext geschrieben und HO und MO haben alle Abbildungen und Ergänzungsdaten vorbereitet. RK und MO führten die chemische Analyse durch. YA, EF, HO und JT führten eine DNA-Analyse durch. Alle Autoren führten Feldforschungen durch und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Jun-ichi Takahashi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kubo, R., Asanuma, Y., Fujimoto, E. et al. Kreuzung zwischen der außerirdischen Hummel Bombus terrestris und zwei einheimischen japanischen Hummeln, B. hypocrita sapporensis und B. cryptarum florilegus, auf der Nemuro-Halbinsel, Japan. Sci Rep 13, 11506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38631-7

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Eingegangen: 28. März 2023

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 17. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38631-7

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