Eine vielseitige Microarray-Plattform zur Erfassung seltener Zellen

Jul 31, 2023

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15342 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Analyse seltener Ereignisse, die in Körperflüssigkeiten mit extrem geringer Häufigkeit auftreten, ist immer noch eine Herausforderung. Wir haben eine vielseitige Microarray-basierte Plattform entwickelt, die in der Lage ist, einzelne Zielzellen aus großen Hintergrundpopulationen zu erfassen. Als Anwendungsfall wählten wir die anspruchsvolle Anwendung der Erkennung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) – etwa eine Zelle unter einer Milliarde normaler Blutzellen. Nach der Inkubation mit einem Antikörpercocktail werden die Zielzellen auf einem Mikroarray in einem Mikrofluidik-Chip extrahiert. Die Zugänglichkeit unserer Plattform ermöglicht die anschließende Wiederherstellung von Zielen zur weiteren Analyse. Der Microarray erleichtert den Ausschluss falsch positiver Erfassungsereignisse durch Co-Lokalisierung und ermöglicht so eine Detektion ohne Fluoreszenzmarkierung. Die Analyse von Blutproben von Krebspatienten mit unserer Plattform hat den Goldstandard erreicht und teilweise sogar übertroffen, was die Machbarkeit für die klinische Anwendung beweist. Klinische Forscher haben die freie Wahl des Antikörpercocktails, ohne dass eine Änderung der Chipherstellung oder des Inkubationsprotokolls erforderlich ist. Dies ermöglicht praktisch willkürliches Targeting von Fängerspezies und damit weit verbreitete Anwendungen in den biomedizinischen Wissenschaften.

Der Nachweis und die molekulare Charakterisierung spezifischer Untergruppen einzelner Zellen, die in Körperflüssigkeiten in extrem geringer Häufigkeit vorkommen, bietet in der Biomedizin ein großes diagnostisches Potenzial, ist jedoch trotz enormer Anstrengungen in den letzten zehn Jahren technisch immer noch sehr anspruchsvoll. Flüssigkeiten wie Blut, Urin, Pleuraflüssigkeit, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit oder Aszites spielen in der medizinischen Diagnostik eine zentrale Rolle, wobei das Blut die am häufigsten genutzte Informationsquelle ist. Neben der Analyse von aus Zellen stammenden Molekülen (z. B. Proteinen, Nukleinsäuren und Metaboliten) kann die Analyse ganzer im Blut zirkulierender Zellen äußerst komplexe Informationen über die Ursache und den tatsächlichen Zustand einer bestimmten Krankheit auf der DNA, RNA und dem Protein liefern Ebene. Beispiele für Anwendungen in der Grundlagen- und angewandten Forschung sind die Analyse seltener T-Zell-Untergruppen im peripheren Blut von Patienten mit Immunstörungen oder Infektionskrankheiten1 sowie zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) bei Krebspatienten, die als „Flüssigbiopsie“ angesehen werden können „2,3, ein neues Diagnosekonzept4, das in den letzten fünf Jahren enormes Interesse gefunden hat5,6,7,8. Fernmetastasen sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle9 und beginnen mit der Freisetzung von Krebszellen aus dem soliden Primärtumor (z. B. Brustkrebs) in den Blutkreislauf10,11. Diese CTCs können sich in entfernten Organen (z. B. Lunge, Leber, Knochen oder Gehirn) ansiedeln und schließlich metastatische Läsionen bilden. Die Analyse von CTCs bietet wichtige Einblicke in die Biologie der Metastasenprogression und neue Perspektiven bei der Behandlung von Krebsmetastasen12,13. Allerdings stellt die Anreicherung und Identifizierung von CTCs aus einer Blutprobe auch nach jahrzehntelanger Forschung immer noch eine große Herausforderung dar, da das Verhältnis zwischen CTCs und Blutzellen etwa 1:109 beträgt (unter der Annahme < 200 CTCs/ml, 5 × 109 Erythrozyten/ ml, 7 × 106 Leukozyten/ml)14. Viele verschiedene Anreicherungsstrategien für CTCs basieren auf einer positiven Selektion, die auf das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) abzielt, und es wurden verschiedene mikrofluidische Ansätze entwickelt, die vielversprechende Ergebnisse zeigen15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Anti-EpCAM-beschichtete Oberflächen interagieren mit EpCAM-Molekülen in der Zellmembran, die die CTCs immobilisieren, während Blutzellen das System übertragen. Die Verifizierung und weitere Analyse der eingefangenen Zellen erfolgt durch Immunfärbung oder andere Ansätze5. Aktuelle Studien haben jedoch gezeigt, dass EpCAM nicht immer ein zuverlässiger Marker ist, da auch EpCAM-negative CTCs im Blut von Krebspatienten entdeckt wurden25,26,27. Ansätze, die auf homogenen, mit Antikörpern beschichteten Oberflächen basieren, weisen eine geringe Spezifität auf, was sie für praktische Anwendungen möglicherweise unwirksam macht. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von CTC-Erfassungsgeräten erforderlich, die (i) leicht auf ein breites Spektrum verschiedener Oberflächenepitope abzielen können, (ii) in der Lage sind, große Blutmengen zu verarbeiten, (iii) eine hohe Spezifität aufweisen und (iv) einzelne Epitope ermöglichen Die Zellanalyse ist immer noch eine Herausforderung, aber sehr gefragt.

Hier stellen wir eine neue CTC-Einfangstrategie auf Basis von Mikromustern vor, die eine hohe intrinsische Spezifität, einen großen Probendurchsatz und einen einfachen Zugang zu eingefangenen Zellen für die Einzelzellanalyse bietet (Abb. 1) – ein Streptavidin-Mikromuster im cm2-Maßstab fungiert als Einfangplattform für Mit biotinylierten Antikörpern vormarkierte CTCs. Daher kann diese Plattform eine große Vielfalt an Biotin-sensibilisierten Zellen einfangen. Das Mikromuster ist Teil eines mikrofluidischen Chips, der die Kontaktwahrscheinlichkeit zwischen markierten CTCs und dem Mikromuster durch eine integrierte Fischgrätenstruktur erhöht17. Letzteres optimiert die Strömungsdynamik zur Verbesserung der CTC-Ansätze. Um die klinische Machbarkeit zu demonstrieren, wurde die Mikromusterplattform in klinischen Proben verwendet, um CTCs aus dem Blut von Brust- und Dickdarmkrebspatientinnen zu isolieren.

CTC-Erfassung und -Extraktion basierend auf der Mikromusterplattform.

(a) CTCs werden mit einem spezifischen biotinylierten Antikörper, z. B. EpCAM oder HER2, oder mit einem Antikörpercocktail inkubiert. Rote Blutkörperchen werden in einem vorherigen Schritt beispielsweise durch ein Dichtegradientenprotokoll oder durch größenbasierte Filtration eliminiert. (b) Beim Pumpen der Zellsuspension durch den Mikrofluidikchip werden aufgrund der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung nur die mit Biotin markierten Zellen auf dem Muster immobilisiert. Eine Fischgrätenstruktur in der Kanaldecke des Chips erzeugt eine Rührströmung, die für Kontaktereignisse zwischen Zellen und dem Mikromuster sorgt. (c) Optionen für die Einzelzellanalyse stehen zur Verfügung, nachdem die Zellen quantifiziert, optisch lokalisiert und mit einer Mikrokapillare aus dem Muster extrahiert wurden. Die Probenbeobachtung kann mit vollständig automatisierten Systemen durchgeführt werden (siehe SI Abb. 7). Reproduktion des Kunstwerks mit Genehmigung von Jill Enders.

Die hier vorgestellte Erfassungsstrategie basiert auf einem funktionalen Punktmuster, um intrinsische Überprüfungen auf falsch positive Ereignisse zu ermöglichen (siehe zweiter Absatz im Abschnitt „Identifizierung und Einzelzellextraktion“), kombiniert mit einem mikrofluidischen chaotischen Mischsystem. Ein Standard-Objektträger für die Mikroskopie wird mit Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet, um sowohl eine passivierende als auch integrative Schnittstelle zu schaffen: passiv, da BSA die unspezifische Bindung von Proteinen und Zellen verhindert; integrativ, da Fluorescein kovalent an BSA-Moleküle binden kann, die durch Photobleichung induziert werden28,29. Letzteres wird ausgenutzt, um ein chemisorbiertes Punktmuster auf dem Objektträger zu erzeugen, das unter strömenden Flüssigkeitsbedingungen stabil ist. Die Lithographie erfolgt mittels Polymerstiftlithographie (PPL), einer Hochdurchsatztechnik mit voller Musterflexibilität30,31. Abbildung 2a zeigt einen schematischen Überblick über den PPL-Prozess: Eine zweidimensionale Anordnung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Pyramiden wird mit einem mit Biotin-4-Fluorescein beschichteten Stück Silizium in Kontakt gebracht, das als „Stempelkissen“ fungiert. Kapillarkräfte bewirken eine Benetzung der Stifte, die dann über den BSA-beschichteten Glasobjektträger geführt werden. Das Punktmuster entsteht durch automatisches Anfahren des Stempels an die Oberfläche. Die piezogestützte Navigation des Stempels bzw. Tisches gewährleistet volle Musterflexibilität. Durch wiederholten Kontakt des Stempels mit der Oberfläche kann innerhalb von zwei Minuten eine homogen gepunktete Oberfläche erzeugt werden, die eine Fläche von 1 × 4 cm2 abdeckt, also 640.000 Merkmale bei einem Punktabstand von 25 μm. Abbildung 2b veranschaulicht die folgenden Schritte zum Erreichen des Streptavidin-Musters. Das Bleichen des Fluorescein-Fluorophors führt zu einer kovalenten photochemischen Bindung an das BSA und hinterlässt nach dem Waschen eine topographisch flache Biotin-Anordnung29. Die kovalente Bindung macht das Muster sehr resistent gegen weitere Waschschritte, Scherkräfte in der Mikrofluidik und Wechselwirkungen mit den eingefangenen Zellen.

Erfassung und Immobilisierung von Biotin-markierten CTCs durch die Mikromusterplattform.

(a) Das Mikromuster wird durch Polymerstiftlithographie (PPL) hergestellt. Die Spitzen aus Polydimethylsiloxan (PDMS) werden mit Biotin-4-Fluorescein beschichtet und dann präzise auf die Oberfläche navigiert, um das Mikromuster auf einer 4 cm2 großen Fläche zu erzeugen. (b) Dieses Schema beschreibt die allgemeinen Schritte bei der Erzeugung des Streptavidin-Arrays. Ein mit einer BSA-Schicht funktionalisierter Objektträger aus Mikroskopieglas ermöglicht die kovalente Bindung des Fluorescein-Tags durch Photobleichung. Nach dem Waschen mit PBS wird ein topographisch flaches Biotin-Array erreicht. Nach der Montage des Fluidsystems wird das Mikromuster mit Streptavidin/cy3 weiter funktionalisiert. (c) Ein Foto des Mikrofluidiksystems, das auf einer Heizplatte befestigt ist. Der Mikroarray auf dem Objektträger ist mit schwarzen Punkten markiert, die der Fluidkammer entsprechen. (d) Das Hellfeldbild zeigt die obere Kanalwand des Mikrofluidikchips, die für einen chaotischen Rührstrom verantwortlich ist. Der Maßstabsbalken entspricht 200 μm. (e) Diese fluoreszenzmikroskopische Aufnahme zeigt eine eingefangene Krebszelle (DAPI-Färbung, alexa488-Sekundärfärbung für Anti-EpCAM), die auf dem Streptavidin-Mikromuster gefangen ist, das im Texas Red-Kanal sichtbar ist. Die Fischgrätenstruktur in der Kanaldecke ist als Schatten sichtbar. Der Maßstabsbalken entspricht 50 μm.

Der mikrofluidische PDMS-Chip wird aus einer vorgefertigten Form gegossen und nach der Sauerstoffplasmabehandlung kovalent an den Mikroskopobjektträger gebunden, der den Mikroarray trägt32. Das Array passt mit seiner Fischgrätentopographie in der oberen Wand zum mikrofluidischen Kanaldesign. Die Mikromusterplattform kann vor der Anwendung monatelang gelagert werden, da das Biotinmuster an der Luft stabil ist und im Vergleich zu Antikörpermustern nicht zum Abbau neigt. Durch den Anschluss des Mikrofluidik-Chips an eine Spritze wird die Kammer mit einer Lösung von Streptavidin/Cy3 gespült, die an den Biotin-Array bindet und ihn in den aktiven Einfang-Array für Biotin-markierte Ziele verwandelt. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges ungebundenes Protein zu entfernen, ist das Gerät für die CTC-Erfassung bereit. Ein Foto des mikrofluidischen Geräts ist in Abb. 2c dargestellt. Um die Zell-Oberflächen-Wechselwirkung zu erhöhen, die bei laminaren Strömungsbedingungen begrenzt ist, verfügt dieses Gerät über eine speziell angefertigte Fischgrätenstruktur in der gesamten Decke (Abb. 2d)33. Die überlagerten Fluoreszenzmikroskopaufnahmen in Abb. 2e zeigen das Streptavidin/cy3-Muster in Rot und eine eingefangene Zelle der Brustkrebszelllinie MCF-7, die mit biotinyliertem EpCAM sensibilisiert wurde. Die Zelle wird mit einem mit Alexa488 markierten Sekundärantikörper gegen Anti-EpCAM und 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) zur nuklearen Gegenfärbung (blau) gefärbt. Die Fischgrätenstruktur erscheint als Schatten im grünen Kanal.

Um das Prinzip zu beweisen, wurden definierte Zahlen von Zellen aus Zellkulturen mit biotinylierten epithelzellspezifischen Antikörpern sensibilisiert, in eine Suspension von Blutzellen oder unbehandelten Zellen gegeben, durch die Mikromusterplattform isoliert und schließlich detektiert und quantifiziert. Obwohl für die Modellversuche der EpCAM-Antikörper verwendet wird, ist dieses Gerät für jedes andere biotinylierte Ziel offen und für Antikörpercocktails geeignet.

Ein Vorteil der Vormarkierung der Zielzellen mit einem Antikörpercocktail anstelle der Verankerung eines Antikörpertyps auf der Oberfläche des Einfanggeräts besteht darin, dass der hergestellte Chip keine Einschränkungen hinsichtlich der Art der gleichzeitig einzufangenden Zelle aufweist. wie auch von Dickson und Mitarbeitern beschrieben10. Tatsächlich kann jede Zelle (oder jedes andere Ziel), die in einem vorherigen Inkubationsschritt durch biotinylierte Antikörper (oder andere Biotin-tragende spezifische Moleküle) sensibilisiert werden kann, mit einer Mikromusterplattform erfasst werden, was eine große Flexibilität bei diesem Ansatz ermöglicht: Nur das Allgemeine Biotin-Konjugat bindet an das Streptavidin. Der Bindungsmechanismus basiert ausschließlich auf der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin. Auch wenn das Inkubationsprotokoll variiert und unterschiedliche Antikörper verwendet werden, ändern sich die Fluidparameter nicht.

Streptavidin-Punkte auf der Unterseite fungieren als Bindungsstellen. Um eine gesättigte Bindung sicherzustellen, wurden 100.000 Zellen in 1 ml PBS mit 0,5 μg biotinylierten Anti-EpCAM-Antikörpern inkubiert, die etwa 8 × 1012 Moleküle darstellen (unter der Annahme von 45 kDa). Frühere Inkubationsexperimente haben gezeigt, dass die Antikörpermarkierung in einem auf 37 °C eingestellten Schüttler für 40 Minuten durchgeführt werden sollte (siehe experimenteller Abschnitt).

Derzeit ist Anti-EpCAM der am häufigsten verwendete Marker für die CTC-Erfassung und wird daher auch in dieser Studie verwendet, um die Vergleichbarkeit mit anderen Erfassungssystemen sicherzustellen. Von einem soliden Tumor stammende CTCs exprimieren EpCAM als Epithelzellen, können jedoch einen Übergang zu einem mesenchymalen Phänotyp durchlaufen26,7. Dieser biologische Prozess ist als Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) bekannt. Unseres Wissens konzentrieren sich die meisten auf mikrofluidischen Oberflächenmarkern basierenden CTC-Erfassungsgeräte auf EpCAM34. Dies ist ein schwerwiegender Nachteil, da EpCAM-negative CTCs für diese Systeme unsichtbar sind. Durch die Markierung von CTCs mit anderen spezifischen Oberflächenantikörpern, etwa dem humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER-2) im Fall von Brustkrebs (siehe Abschnitt „Isolierung von CTCs aus Patienten“), oder sogar mit einem Antikörpercocktail, steigt die Wahrscheinlichkeit Die Zahl der EpCAM-negativen Zellen wird zunehmen. Unser Aufnahmegerät ist für die Anwendung von Antikörpercocktails ohne weiteren Anpassungsbedarf geeignet.

Auf mikrofluidischen Chips basierende Einfangansätze zielen in erster Linie auf die CTC-Quantifizierung ab, jedoch können in diesen geschlossenen Systemen auch Immunzytochemie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) an eingefangenen Zellen durchgeführt werden. Aufgrund der dreidimensionalen Innenarchitektur, die homogen mit funktionellen Molekülen beschichtet ist (siehe CTC- und HB-Chip sowie Plattformen auf Basis von Microposts)17,19,35 können eingefangene CTCs aus diesen Systemen nicht weiter extrahiert und einzeln untersucht werden. Für weitere Untersuchungen ist es von Vorteil, die Zellen auf einer ebenen Oberfläche zu immobilisieren. Der hier vorgestellte Ansatz soll CTCs ausschließlich auf dem funktionellen Mikromuster immobilisieren; Andere Oberflächen wie die Decke mit Fischgrätenmuster und die Kanalwände sind mit BSA passiviert, um die Zellbindung dort zu verhindern. Wenn die eingefangenen CTCs auf einer ebenen Fläche liegen, können sie durch Mikromanipulation aufgenommen werden. Abbildung 3a zeigt eine Überlagerung von Fluoreszenz- und Hellfeld-Mikroaufnahmen, die den Kommissioniervorgang veranschaulichen. Zwei eingeschlossene Zellen binden an Streptavidin-Punkte; Eine Glaskapillare mit einem Radius von 40 μm nähert sich einer Zelle von oben. Anschließend wird die Zelle vom Punkt gelöst, indem man die Öffnung über die Zelle stülpt und vorsichtig darunter kratzt. Ein einstellbarer Zuflussstrom lockert die Zelle und befördert sie in die Kapillare. Die Spitze der Kapillare kann dann in einen Behälter geführt werden und ein austretender Strom spült die Zelle hinein. Abbildung 3c zeigt die beispielhafte Ablagerung von zwei zuvor ausgewählten Zellen (die nicht den Zellen in Abb. 3a,b entsprechen) auf einer Glasoberfläche. Abbildung 3b zeigt die gleiche Stelle wie in Abb. 3a, nachdem die Zellen aus dem Muster ausgewählt wurden. Die Überlagerung des Texas Red-, FITC- und DAPI-Kanals beweist, dass sich die beiden Zellen aufgrund des Fehlens des durch DAPI gefärbten Zellkerns von den Punkten gelöst haben. Die Punkte, an denen die Zellen zuvor angeklebt waren, sind nicht beschädigt. Es bleiben jedoch kleine grüne Flecken um die Streptavidin-Punkte herum. Wir konnten jedoch zeigen, dass die Zellen nach der Entnahme noch morphologisch intakt waren (siehe Abb. 3d). Da die Affinität zwischen Streptavidin und Biotin (die zu den stärksten in biologischen Systemen gehört)36 stärker ist als EpCAM/Anti-EpCAM oder die Kraft, die erforderlich ist, um EpCAM aus der Zellmembran zu extrahieren, schließen wir, dass diese Reste mit oder ohne Anti-EpCAM zu Anti-EpCAM gehören angehängte EpCAM-Proteine. Im Prinzip könnte das Extraktionssystem automatisiert werden, da die eingefangenen Zellen alle auf einem Raster positioniert werden, das durch das Mikromuster definiert wird. Daher können sie durch die Extraktionskapillare angesprochen werden, sobald ein automatisches Wiederherstellungssystem mit dem Muster registriert ist, was die vollautomatische Wiederherstellung aller eingefangenen Zellen ermöglicht.

Einzelzellextraktion.

(a) Die mikroskopische Aufnahme zeigt eine Überlagerung des Texas Red-, FITC- und DAPI-Kanals, die das Streptavidin-Muster in Rot, den Zellkern in Blau und Anti-EpCAM in Grün von zwei kolokalisierten MCF-7-Zellen veranschaulicht. Eine Glasmikropipette mit einem Durchmesser von 40 μm wird über den Zellen positioniert, bevor sie aus dem Muster extrahiert werden. Der Maßstabsbalken entspricht 30 μm. (b) Nach der Entfernung der Zelle durch Mikromanipulation verbleiben kleine Rückstände von Anti-EpCAM auf der Oberfläche. Der Maßstabsbalken entspricht 30 μm. (c) Eine Kapillare lagert zwei Zellen auf einer Glasoberfläche ab, die aus einem Muster ausgewählt wurden (entspricht nicht den Zellen in (A) und (b)). Der Maßstabsbalken entspricht 15 μm. (d) Die mikroskopische Aufnahme der gefärbten Zelle zeigt, dass die Zellen nach der Extraktion aus dem Muster intakt bleiben. Der Maßstabsbalken entspricht 10 μm.

Im Gegensatz zu anderen CTC-Chips, die eine homogene Antikörperbeschichtung an den Innenwänden aufweisen, basiert unsere Erfassungsstrategie auf Punkt-Microarrays und bietet eine intrinsische Spezifitätsverbesserung durch Co-Lokalisierungserkennung (Abb. S2). Obwohl alle CTC-Chips nach dem Bindungsvorgang mit Puffer gespült werden, bleiben möglicherweise einige Blutzellen durch unspezifische Adhäsion zurück. Da die Zahl der Nicht-CTCs die tatsächlichen CTCs um mehrere Größenordnungen übersteigt, ist zu erwarten, dass falsch positive (dh unspezifisch anhaftende „eingefangene“ Zellen) auf homogen beschichteten Oberflächen ein ernstes Problem darstellen. Obwohl die absolute Anzahl unspezifisch anhaftender Zellen durch das Mikromuster nicht reduziert wird, können die unerwünschten Zellen viel einfacher identifiziert werden: Die Co-Lokalisierung unseres Ansatzes führt zu einer direkten Sortierung in positive und negative Zellen. Nach der Inkubation der Probe wird erwartet, dass Zellen, die sich auf den fluoreszierend markierten Streptavidin-Punkten befinden, den Biotin-Anker tragen und daher positiv für EpCAM oder andere entsprechende biotinylierte Antikörper sind. Im Gegensatz dazu können wirklich negative Ereignisse, also Zellen, die sich zwischen Streptavidin-Punkten befinden, für die weitere Analyse verworfen werden, da ihre Wahrscheinlichkeit, falsch negativ zu sein, gering ist. Wenn Sie also die Position der Punkte kennen, können Sie die Erfassung eines CTC verifizieren, indem Sie eine einfache Co-Lokalisierungsanalyse zwischen einer anhaftenden Zelle und dem Erfassungspunktarray durchführen. In dieser Studie wurden sowohl antikörperpositive als auch negative Zellen, die auf dem Microarray verblieben waren, gefärbt, um die Werte für Effizienz und Spezifität eindeutig zu bewerten.

Abbildung 4a zeigt markierte Zellen der Brustkrebszelllinie MCF-7, die mit einem sekundären Anti-Maus-Fluorophor gegen EpCAM gefärbt sind, im grünen Kanal und Leukozyten (Kern gefärbt mit DAPI-Blau) auf einem Streptavidin/cy3-Punktmuster in Rot . Der Punktabstand beträgt 20 µm. Die Anziehungskraft der grün markierten Zellen auf das Muster ist deutlich sichtbar. Leukozyten, die sich zudem durch ihre geringere Größe auszeichnen, sitzen nicht auf Punkten. Diese Zellen sind für die CTC-Quantifizierung und weitere Analyse vernachlässigbar. Durch die schmale Musterung können einige Zellen eine Brücke zwischen zwei Punkten bilden. Dies ist ein Nachteil, wenn nur die Hellfeld-Mikrofotografie betrachtet wird, da diese Zellen als negative Ereignisse betrachtet würden. Sogar einzelne Zellen können möglicherweise zwei Punkte überbrücken, wenn der Punktabstand zu eng ist. Um dies zu vermeiden, wird das Punktmuster mit einem größeren Abstand hergestellt (Abb. 4b). Dann können Zellen eindeutig den Punkten zugeordnet und als positive Ereignisse gewertet werden.

Einfangen sensibilisierter Zellen durch Mikroarrays im Vergleich zur homogenen Beschichtung.

(a) Mit biotinyliertem Anti-EpCAM (grün) markierte MCF-7-Brustkrebszellen werden mit Leukozyten (DAPI-Färbung blau) gemischt und auf dem Streptavidin-Muster (rot) inkubiert. Während die positiven Zellen eine deutliche Anziehungskraft auf die Punkte zeigen, zeigen die Biotin-negativen Leukozyten keine eindeutige Reaktion auf das Muster. Der Punktabstand von 20 μm ist klein genug, um einzelnen Zellen die Möglichkeit zu geben, Punkte zu überbrücken. Durch die Vergrößerung des Punktabstands in (b) werden die einzelnen auf den Punkten eingefangenen Tumorzellen voneinander getrennt. (c) Eine homogene Antikörperbeschichtung lässt allein durch die Position keinen Rückschluss auf die Bindungszellen zu. Die mikroskopische Aufnahme zeigt Biotin-negative Zellen (nur DAPI-Färbung) und Biotin-positive Zellen (Sekundärfärbung in Grün), die sich zufällig an die Oberfläche binden. Eine Zellidentifizierung kann durch die Position nicht durchgeführt werden. Die Maßstabsbalken entsprechen in allen Bildern 20 μm.

Die Notwendigkeit von Punktmustern als Erfassungsplattform wird deutlich, wenn man Abb. 4c betrachtet, die das Ergebnis eines Erfassungsexperiments unter Verwendung eines homogen beschichteten Streptavidin-Chips zeigt. Hier wurden 50 % der MCF-7-Zellen mit biotinyliertem EpCAM markiert; Die andere Hälfte wurde nicht als negative Zellen gekennzeichnet. Beim Pumpen und Inkubieren der Zellen durch einen homogen beschichteten Streptavidin-Chip verbleiben sowohl positive als auch negative Zellen auf dem Chip; auch nach dem waschen. Die unspezifisch gebundenen negativen Zellen erlauben keinen Rückschluss auf den Zelltyp, sofern keine weitere Fluoreszenzfärbung durchgeführt wird.

Die geringe Menge an CTCs im Blut stellt eine Herausforderung für alle Erfassungsstrategien dar. Zum Nachweis von CTCs muss ein Blutvolumen von 5–10 ml verarbeitet werden. Beispielsweise liefert das kommerzielle CellSearch®-System klinisch relevante Ergebnisse mit Blutvolumina von 7,5 ml. Wenn spezifische Oberflächenproteine ​​als CTC-Marker eingesetzt werden sollen, müssen alle Blutzellen mit einer interagierenden Oberfläche in Kontakt gebracht werden.

Unsere ersten Experimente zum Nachweis der Stabilität und Bindungseffizienz der Mikromuster wurden mit 100 μL Zellsuspension auf Deckglasplattformen durchgeführt. Wir haben EpCAM-Mikromuster durch direkte Proteinablagerung erstellt und versucht, biotinyliertes EpCAM auf einem Streptavidin-Muster zu inkubieren29. Allerdings zeigten beide Ansätze bei einer Kurzzeitinkubation von 15 Minuten keine ausreichenden Bindungsergebnisse. Durch die Sensibilisierung von Zielzellen mit biotinyliertem EpCAM kann man sich die starke Affinität zwischen Streptavidin und Biotin zunutze machen. Live-Imaging-Experimente zeigen, dass 80 % der biotinylierten Zellen unmittelbar nach der Berührung auf einem Streptavidin-Punkt gefangen sind (siehe SI-Video 1). Allerdings wird die Verwendung von Deckgläsern ohne mikrofluidische Unterstützung das Volumenproblem nicht lösen, da die meisten Blutzellen keine Chance haben, die funktionalisierte Oberfläche zu berühren. Durch die Entwicklung eines mikrofluidischen Chips mit einer Fischgrätenstruktur, die das Mikromuster umhüllt, wird die Zell-Oberflächen-Interaktion und damit die Bindungswahrscheinlichkeit erhöht.

Abbildung 5 veranschaulicht die homogene Leistung des Chips über verschiedene Verhältnisse von positiven und negativen Zellen. MCF-7-Zellen wurden mit biotinyliertem EpCAM sensibilisiert und in lysiertes Erythrozytenblut mit 2 × 106 Leukozyten oder in eine unbehandelte Zellsuspension von MCF-7-Zellen gegeben. Diese Suspensionen wurden anschließend durch die Mikromusterplattform gepumpt, während die Temperatur bei 37 °C gehalten wurde, da wir herausfanden, dass die Bindungseffizienz biotinylierter Zellen, die auf Mikromustern auf Deckgläsern inkubiert wurden, bei Raumtemperatur niedrig war. Die Bindungseffizienz verringerte sich um etwa 30 %, wenn der Chip bei Raumtemperatur statt bei 37 °C verwendet wurde (Abb. S11), da bei Körpertemperatur die Wahrscheinlichkeit höher ist, dass lebensfähige Zellen auftreten und diese aktiv an das Muster binden können. Bindungseffekte nehmen zu, wenn die Zellen eine längere Kontaktzeit mit einem Punkt haben, also eine geringere Geschwindigkeit. Durch die Unterbrechung des Flusses verringert sich die Zellgeschwindigkeit in der Kammer, was zu einer längeren Reaktionszeit zwischen Zellen und Punkten führt. Nach diesem Protokoll konnten wir durchschnittliche Wiederfindungsraten von etwa 50 % und eine hohe Spezifität zwischen 86 % und 96 % erreichen.

Leistung des vorgestellten Microarray-CTC-Chips.

Dieses Diagramm zeigt Wiederfindung, Effizienz und Spezifität von drei verschiedenen Dotierungs-/Verdünnungsexperimenten. Die Erholung beschreibt die Gesamtleistung des jeweiligen Experiments. Es wird deutlich, dass alle drei Experimente ein ähnliches Verhalten aufweisen und Wiederfindungen von 40 bis 60 %, eine Effizienz von 60 bis 80 % und eine Spezifität von mehr als 85 % aufweisen.

Um die Machbarkeit des vorgestellten Systems im klinischen Umfeld zu unterstreichen, wurde eine Reihe von Blutproben von neun Brust- und einer Darmkrebspatientin analysiert. Als Negativkontrollen dienten Proben gesunder Personen. Wir konnten eindeutig zeigen, dass die zur Identifizierung der Zellen verwendeten Antikörper keine unspezifischen Bindungseffekte zeigen, d. h. in Blutproben gesunder Personen nach FICOLL- oder Parsortix-Voranreicherung (n = 10) wurden keine Keratinsignale beobachtet (Daten nicht gezeigt) . Jeder Patient spendete eine ausreichende Menge Blut, um eine parallele Untersuchung mit dem von der FDA zugelassenen CellSearch®-System (7,5 ml Blut pro Patient) zu ermöglichen, da dieses System als „Goldstandard“ für alle anderen CTC-Nachweismethoden angesehen werden kann. Vor dem Pumpen der Blutprobe durch das Mikrofluidikgerät wurden CTCs durch Größenfiltration mit dem Parsortix-System (ANGLE Plc) vorangereichert (4 ml Blut pro Patient), hauptsächlich um rote Blutkörperchen zu extrahieren und die Anzahl der Leukozyten zu reduzieren. Zellen mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm wurden vom Parsortix-System eingefangen, geerntet und einem Antikörpercocktail aus biotinylierten Anti-EpCAM- und Anti-HER2-Antikörpern ausgesetzt. Der letzte Pumpschritt durch die Mikromusterplattform erfolgte nach dem für das Modellsystem festgelegten Protokoll, dh bei 37 °C und mit definierter Strömungsdynamik. Die Identifizierung von CTCs erfolgte durch Immunfärbung unter Verwendung des CellSearch®-Antikörpercocktails (Keratin+(orange), DAPI+(blau), CD45− (rot)) für den besten Vergleich.

CTCs wurden in 6 von 10 Blutproben mithilfe der Mikromusterplattform entdeckt (Bereich von 0,75–2 CTCs pro ml). Vier Proben wurden als negativ eingestuft, da sowohl CellSearch® als auch der Microarray-Ansatz keine CTCs finden konnten. In 3 der verbleibenden 6 Blutproben fand CellSearch® mehr CTCs, als von unserem System erfasst wurden (Bereich von 3,7–7,6 CTCs/ml durch CellSearch®, 1,25–2 CTCs/ml durch die Mikromusterplattform, Abb. S12). Diese Patienten hatten jedoch eine hohe Anzahl apoptotischer CTCs, die wahrscheinlich zu klein waren, um mit dem größenbasierten Parsortix-System extrahiert zu werden (<10 μm, Abb. S13). Darüber hinaus ist die Microarray-Plattform für die Erfassung lebensfähiger Zellen konzipiert, da wir zeigen konnten, dass die Erkennungsrate für apoptotische Zellen abnimmt (Abb. S11). Dennoch zeigte ein Erfassungsexperiment die gleiche Leistung im Vergleich zu CellSearch® und zwei Blutproben von Patienten wurden mit unserem neuartigen Gerät sogar positiv getestet, während CellSearch® negativ war. Dies kann wahrscheinlich auf den Antikörpercocktail zurückgeführt werden, der auch HER2-positive/EpCAM-negative Zellen einfangen kann, die von CellSearch® übersehen wurden. Abbildung 6 zeigt repräsentative mikroskopische Aufnahmen von CTCs aus einer Probe einer Brustkrebspatientin, die mit der neuen Mikromusterplattform aufgenommen wurden.

Mittels Mikromuster aus dem Blut einer Brustkrebspatientin gewonnene CTCs.

Die Fluoreszenzmikroskopaufnahmen zeigen CTCs in Kontakt mit dem Mikromuster an verschiedenen Stellen auf dem Chip. CTCs werden durch Immunfärbung mit dem CellSearch®-Antikörpercocktail verifiziert. Die Maßstabsbalken entsprechen 20 μm.

Unsere Strategie zur Erfassung kaum vorkommender Zellen in großen Hintergrundpopulationen auf Basis einer Mikromusterplattform mit mikrofluidischer Unterstützung wurde im Rahmen dieses Berichts am Beispiel der CTC-Isolierung aus Patientenblut demonstriert. Streptavidin-Punkte fungieren als Einfangplattform für die mit biotinylierten Antikörpern vormarkierten Zielzellen. Um die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen den Zielen und dem Mikromuster zu maximieren, ist die Plattform in einen mikrofluidischen PDMS-Chip eingekapselt, der in der oberen Kanalwand eine Fischgrätenstruktur trägt, die eine chaotische Rührströmung verursacht. Im Gegensatz zu anderen CTC-Chips5 ermöglicht der vorgestellte Ansatz die Identifizierung der Zielzellen/CTCs ohne Sekundärmarkierung aufgrund einer hohen Spezifität und einer intrinsischen zusätzlichen Kontrolle gegen unspezifische Adhäsion durch die Co-Lokalisierung mit den fluoreszierenden Einfangpunkten. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, einzelne Zielzellen durch Mikromanipulation einfach auszuwählen, um zusätzliche molekulare und einzelne Zellanalysen durchzuführen37,38. Darüber hinaus sind die von unserem Gerät erfassten Tumorzellen lebensfähig, was im Prinzip weitere funktionelle CTC-Analysen einschließlich der Etablierung von Zellkulturen und Xenotransplantaten6,7,39,40,41 ermöglicht. Die derzeitige Effizienz der Expansion von CTCs in vitro oder in vivo ist jedoch eher gering niedrig und Expansion funktioniert nur bei Patienten mit sehr fortgeschrittener Erkrankung7,39,40,41,42. Daher sind zukünftige Studien erforderlich, um sich auf diesen wichtigen Aspekt zu konzentrieren.

Die als Flüssigbiopsie bekannte häufige Quantifizierung und molekulare Analyse von CTCs vor und während der Behandlung könnte einen Echtzeitstatus des Patienten liefern und nicht das feste einmalige histopathologische Ergebnis des Primärtumors34. Es kann viele Jahre dauern, bis sich offene Metastasen entwickeln (z. B. bei Brustkrebs mehr als 10 Jahre nach der Diagnose des Primärtumors), und dieser Prozess wird durch verschiedene Selektionszwänge, einschließlich Krebsbehandlungen wie Chemotherapie, beeinflusst. Daher reicht die Analyse des Primärtumors – als aktueller diagnostischer Ansatz in der klinischen Onkologie – nicht aus, um die beste Behandlung gegen die metastatischen Zellen auszuwählen, die aus diesem Selektionsprozess hervorgehen. Da Biopsien offener Metastasen ein invasives und schwieriges Verfahren sind, abhängig von der Lage der Metastasenstelle (z. B. Lunge oder Gehirn), ist die Analyse peripherer Blutproben auf CTCs, die von Metastasen stammen, eine einfachere Alternative.

Im allgemeineren Ansatz wird die freie Wahl des Markierungsantikörpers durch den vorherigen Inkubations- bzw. Sensibilisierungsschritt ohne weitere Anpassung gewährleistet. Daher können neben EpCAM auch andere biotinylierte CTC-spezifische Oberflächenproteine ​​​​angegriffen werden. Wir demonstrierten die Idee mit der Anwendung eines EpCAM- und HER2-Antikörpercocktails, um EpCAM-negative CTCs zum Einfangen einzubeziehen, und durch die Auswahl völlig anderer Antikörper konnte jedes andere Antikörperziel extrahiert werden. Somit kann eine Mikromusterplattform dazu genutzt werden, eine Vielzahl von CTCs oder anderen Zellen von Interesse zu erfassen, die gezielt mit Antikörpern angegriffen werden, im Allgemeinen jedoch mit Biotin markiert sind.

Es wurde gezeigt, dass der vorgestellte CTC-Chip in der Lage ist, CTCs aus tatsächlichen Blutproben von Patienten zu erfassen und dabei eine Leistung zeigt, die mit dem aktuellen klinischen Goldstandard (CellSearch®) vergleichbar oder sogar komplementär ist. Dass dies bereits in dieser frühen Proof-of-Principe-Studie erreicht wurde, zeigt den Wert dieses Ansatzes für die weitere Entwicklung mikrofluidischer CTC-Chips. Im Gegensatz zu der Fülle an Microarray-Plattformen, die in den letzten Jahren entwickelt wurden5,43,44,45, zeichnet sich unser neues Gerät durch ein hohes Maß an benutzerfreundlicher Flexibilität und den Verzicht auf teure Gerätekosten aus. Neben der freien Auswahl von Antikörpern zum Einfangen von CTCs (oder anderen interessierenden Zellen) kann unsere aktuelle Technologie mit fast jeder Voranreicherungsmethode kombiniert werden, einschließlich unvoreingenommener, markierungsfreier Ansätze5, wie in der vorliegenden Untersuchung gezeigt. Alternative Ansätze zur Erfassung seltener Ereignisse umfassen die Durchflusszytometrie, die in den meisten Institutionen am häufigsten verwendete Technik. Allerdings sind selbst Hochdurchsatz-Durchflusszytometer der neuen Generation mit der extrem geringen Häufigkeit von CTCs konfrontiert.

Zukünftige Anwendungen könnten neben der CTC-Analyse auch die Analyse seltener T-Zell-Untergruppen umfassen, die durch spezifische Zelloberflächenmoleküle gekennzeichnet sind, die mit Antikörpern angegriffen werden können, sowie zirkulierende Endothelzellen (CECs) und zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPCs), die bei pathologischen Prozessen auftreten und stören Endothelfunktion, fetale Zellen aus mütterlichem Blut, infizierte Zellen, die abnormale Oberflächenmarker exprimieren, und Bakterien45.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration des Weltärztebundes von Helsinki und den Richtlinien für Experimente am Menschen der Hamburger Ärztekammer durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission der Hamburger Ärztekammer genehmigt (Genehmigungsnummer PVN-3779). Alle Teilnehmer gaben vor Beginn der Studie eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Das genaue Protokoll für die Erzeugung von Biotin-Microarrays durch PPL ist in der Literatur29 und im SI im Detail angegeben.

Die Geräteherstellung erfolgte durch eine schnelle, kostengünstige Mikroformtechnik.

Als Substratmaterial für die Form wurde ein 4''-Glaswafer verwendet. Die Umkehrung der mikrofluidischen Strukturen wurde in einem biokompatiblen Trockenfilmresist (Ordyl SY330, Elga Europe, Italien) mit einer Dicke von 55 μm gebildet46,47. Für die Formherstellung wurde die erste Resistschicht bei einer Temperatur von 95 °C auf das Glassubstrat laminiert und fotolithografisch strukturiert. Um die gewünschte Fischgrätenstruktur in der oberen Wand des Mikrofluidikkanals zu erreichen, wurde eine zweite Schicht Trockenfilmresist auf die Struktur laminiert und strukturiert, was zu einer Gesamthöhe von 110 μm führte. Nach der Resistentwicklung wurde flüssiges, entgastes PDMS über die fertige Form gegossen. Nach dem Erstarren wurde PDMS abgezogen und Löcher für Flüssigkeitsverbindungen gestanzt. Im nächsten Schritt wurde eine Sauerstoffplasmabehandlung der Unterseite des PDMS durchgeführt. Das PDMS wurde auf den mikrostrukturierten Objektträger aus Mikroskopglas geklebt. Schließlich wurden Schläuche mit Spritzennadeln in die gestanzten Löcher für die Flüssigkeitsanschlüsse gesteckt, um den mikrofluidischen Chip fertigzustellen.

Der mikrofluidische Chip ist mit 1/32-Zoll-Schläuchen verbunden, die in die vorgesehenen Einlass- und Auslassanschlüsse eingeführt werden. Der Eingangsschlauch ist mit einem 3-Wege-Hahn verbunden, der wiederum mit einer Spritze verbunden ist. Eine mikrofluidische Spritzenpumpe (NE-1002X, FisherScientific, USA) wird verwendet, um die Flüssigkeiten reproduzierbar durch den Chip zu pumpen. Um eine gleichmäßige Benetzung der gesamten Kammer zu ermöglichen und unspezifische Proteinbindung an den Kanalwänden zu blockieren, werden 100 μl Rinderserumalbumin (1 % w/v) und Tween20 (1 % v/v) in den Chip gepumpt und dort inkubiert 30 Minuten. Dann ersetzen 200 μL Streptavidin/cy3 in PBS (0,5 % V/V) die vorherige Lösung, um Streptavidin an das Biotinmuster zu binden. Nach dem Spülen mit 500 μL PBS ist der Chip gebrauchsfertig.

4 ml Vollblut eines gesunden Spenders wurden in einem EDTA-Röhrchen gesammelt. Zur Trennung zwischen roten Blutkörperchen und mononukleären Zellen wurde ein allgemeines Dichtegradientenprotokoll angewendet: Blut wurde in ein Falkenröhrchen gegeben, mit 30 ml HBSS (Biochrom, Deutschland) gefüllt und 10 Minuten lang bei 400 g und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 30 ml PBS resuspendiert und 20 ml Ficoll (GE Healthcare, UK) wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 4 °C und 400 g zentrifugiert. Die Schnittstelle und der Überstand, der die mononukleären Zellen (dh Leukozyten) enthielt, wurden in ein neues 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt. Das Röhrchen wurde mit PBS gefüllt und 10 Minuten lang bei 4 °C und 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 1 ml 1 × H-Lyse-Puffer (R&D Systems, USA) resuspendiert und 3 Minuten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. 30 ml PBS wurden hinzugefügt und die Probe wurde erneut 10 Minuten lang bei 4 °C und 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in warmem PBS resuspendiert, um die biotinylierten MCF-7-Zellen in die Suspension zu versetzen.

4 ml (Parsortix in Kombination mit dem neu entwickelten Mikrofluidikgerät) bis 7,5 ml Blut (CellSearch®) wurden von zehn Krebspatienten (Brust und Darm) entnommen, die positiv auf Fernmetastasen waren. Blutproben wurden für beide Tests parallel analysiert. Das Parsortix-System wurde als Voranreicherung für CTCs vor der Verwendung des Chip-Assays verwendet. Zur Isolierung von CTCs mithilfe von CellSearch® wurde der CTC-Nachweis wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt48. Zu den Kriterien für die Definition eines Ereignisses als CTC gehören für beide Tests: eine runde bis ovale Morphologie, ein sichtbarer Zellkern (DAPI+) und ein positives Färbemuster für eine epithelspezifische Zelle (Keratin+ und CD45−).

Zellen der Krebszelllinie MFC-7 wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), einschließlich 10 % fötalem Kälberserum (FCS), bei 10 % CO2 in einem 25-cm2-Kolben kultiviert. Die Zellen wurden mit warmem PBS gewaschen und nach 2-minütiger Inkubation mit Trypsin abgelöst und mit warmem DMEM gespült. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in warmem BSA/PBS 0,1 % w/V resuspendiert und gezählt. 100.000 Zellen in warmem PBS/BSA wurden dann entweder mit 0,5 μg biotinyliertem Anti-EpCAM (VU-1D9, Abcam, UK) oder biotinyliertem Anti-HER-2 (3B5, Abcam, UK) in einem Schüttler (Eppendorf Thermomixer Comfort, Hamburg) inkubiert , Deutschland) bei 300 U/min bei 37 °C für 40 Minuten rotieren. Anschließend werden die Zellen zentrifugiert und in warmem PBS suspendiert. Der Anteil toter Zellen wird vor dem Aufstocken gezählt. Um eine genaue Anzahl an dotierten Krebszellen zu erreichen, wird die Suspension auf 10.000 Zellen/ml verdünnt; Anschließend werden 5 Tropfen 10 µL Suspension auf einen Glasobjektträger pipettiert und die Zellen gezählt.

Positive und negative Zellen werden in 1 ml PBS gemischt und in eine 3 ml-Spritze (BD Bioscience, USA) pipettiert, die mit Aluminiumfolie abgedeckt ist, um eine Temperatur von 37 °C zu halten. Um zu verhindern, dass Luftblasen in das System gelangen, wird die Mikrofluidikpumpe vertikal platziert (Fotos siehe SI). Die Pumpe wird mit individuellen Parametern gemäß dem vorgegebenen Protokoll eingestellt. Am häufigsten wird eine Flussrate von 20 μL/min verwendet. Der Chip wird auf eine Heizplatte (Heidolph MR Hei-Tec, Schwabach, Deutschland) gelegt, die auf 37 °C eingestellt ist. Die das Gerät am Ausgang verlassenden Zellen werden in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Nicht im Microarray anhaftende Zellen werden mit 500 μL warmem PBS (50 μL/min) gespült und im selben Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Diese Zellen werden dann 3 Minuten lang bei 2.000 U/min auf einem Superfrost-Glasobjektträger (Menzel-Gläser, Deutschland) zytospinnen, mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert, für die anfängliche EpCAM-Markierung plus DAPI gefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Es werden mindestens fünf mikroskopische Aufnahmen mit geringer Vergrößerung (5×, 10×) des zytospinnenden Bereichs gemacht und die durchschnittliche Zellzahl im gesamten Bereich berechnet. Diese Zahlen werden verwendet, um die Gesamtwiederherstellung zu ermitteln. Die Zellen in der Kammer können 15 Minuten lang mit PFA fixiert und mit DAPI (1:1000) und einem sekundären Antikörper gegen Mäuse, die ein Alexa488-Fluorophor (1:200) tragen, gefärbt werden. Um den Überschuss an färbenden Antikörpern zu entfernen, wird der Chip mit einer weiteren Ladung PBS (500 μl, 50 μl/min) gespült. Die Anzahl der gebundenen Zellen wird dann durch Zählen mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Bei der Extraktion gebundener Zellen mit einer an einen Mikromanipulator angeschlossenen Kapillare werden die Zellen nicht fixiert. Der mikrofluidische PDMS-Chip kann mit einem Skalpell aufgeschnitten werden, um Zugang zu den Zellen zu erhalten.

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Diese Arbeit wurde mit Unterstützung der Karlsruhe Nano Micro Facility (KNMF, www.knmf.kit.edu) durchgeführt, einer Helmholtz-Forschungsinfrastruktur am Karlsruher Institut für Technologie (KIT, www.kit.edu). Live-Cell-Imaging-Experimente wurden am Microscopy Imaging Facility (UMIF) des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf (UKE) mit Unterstützung von Dr. Bernd Zobiak durchgeführt. Besonderer Dank gilt Dr. Sylwia Sekula-Neuner, Anna Babayan, Isabel Stückrath und Julia Spötter für die anregenden Diskussionen und die Unterstützung im Bereich Zellkultur. Die Autoren würdigen den Entwurf von Jill Ender in Abbildung 1. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Open Access Publishing Fund des Karlsruher Instituts für Technologie für die Unterstützung.

Hirtz Michael, Haller Anna und Gorges Tobias M. haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Pantel Klaus und Fuchs Harald haben diese Arbeit gemeinsam betreut.

Institut für Nanotechnologie (INT) und Karlsruhe Nano Micro Facility (KNMF), Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Deutschland

Falko Brinkmann, Michael Hirtz & Harald Fuchs

Physikalisches Institut und Zentrum für Nanotechnologie (CeNTech), Universität Münster, Deutschland

Falko Brinkmann & Harald Fuchs

Institut für Sensor- und Aktorsysteme, Technische Universität Wien, Österreich

Anna Haller

Abteilung für Tumorbiologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland

Tobias M. Gorges

Institut für Mikrosensorik, -Aktuatoren und –Systeme, Universität Bremen, Deutschland

Michael J. Vellekoop, Sabine Riethdorf & Klaus Pantel

Abteilung für Gynäkologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland

Volkmar Müller

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FB stellte die Mikroarrays her und baute die Mikrofluidik zusammen, und FB und TMG führten die Experimente mit den neuen Einfanggeräten durch. AH und MJV stellten die Mikrofluidikteile mit Fischgrätenstruktur zur Verfügung und halfen beim Design der Mikrofluidik. FB und MH analysierten die Ergebnisse. FB, MH, KP und HF haben die Experimente entworfen. SR und VM stellten den Patienten Blutproben zur Verfügung. TMG bereitete die Blutproben der Patienten vor. TMG und SR führten die CellSearch-Experimente durch. FB, MH, AH und KP haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 20. Mai 2015

Angenommen: 23. September 2015

Veröffentlicht: 23. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15342

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